皮肤组织工程是大面积皮肤缺损修复的新的希望。种子细胞和生物相容性支架材料是组织工程的核心问题。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是种子细胞的研究热点。脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ASCs)易获得,可跨胚层多向分化,增殖速度快,是优秀的组织工程种子细胞。实验证实脂肪干细胞可减轻炎症反应,促进肉芽组织沉积,促进再上皮化、血管重建及创面收缩,并可分化为表皮细胞、血管内皮细胞,因而可促进创面愈合,与骨髓间充质干细胞相比,其细胞表型更接近髓核样细胞。干细胞移植治疗后,存活率低且存活时间短,这被认为是限制基于骨髓间充质干细胞治疗的主要瓶颈。生物医学工程的发展带来的支架材料的改进为干细胞再生治疗提出了新的策略。课题组成员清华大学生物医学工程系在前期研究工作发明了一种新型的微尺度的可注射明胶微冰胶(gelatin microcryogels,GMs),呈多孔隙连通结构,具有良好的注射性和组织相容性,可为干细胞提供不被体内退变微环境损伤的三维支持,因此,是一种理想的可注射生物支架材料。研究目的1.将人脂肪干细胞接种于明胶微冰胶三维材料中,比较三维培养与常规二维培养对脂肪干细胞生物学性能的影响。2.将明胶微冰胶+脂肪干细胞复合物移植治疗裸鼠背部全层皮肤缺损创面,观察其对创面修复的影响,并研究相关机理。研究方法1.选择人脂肪抽吸手术所得脂肪组织作为脂肪来源,参照Zuk等方法建立了人脂肪干细胞的分离、培养和鉴定的平台,并观察其向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的能力。2.将人脂肪干细胞接种于明胶微冰胶三维材料中,观察其接种率,并比较三维培养与常规二维增殖率、抗H2O2诱导凋亡能力,QPCR法检测干性基因(OCT4、SOX2和Nanog)及细胞生长因子基因(VEGF、EGF、bFGF、FDGFbb)的表达,并用ELISA法检测细胞生长因子的蛋白水平3.建立裸鼠背部全层皮肤缺损模型,并设立治疗组(GMs+Cells),对照组1(Cells),对照组2(GMs)和空白对照组(sham)做对照,通过大体创面观察,测定各组愈合曲线；通过活体成像观察,确定细胞在裸鼠体内的存活情况；在术后11d获取标本,通过标本HE染色,免疫组化检测等方法观察和检测CK14、PCNA表达水平,并抗人细胞核抗体、抗GFP抗体染色初步观察脂肪干细胞注射至裸鼠创面的存活和转归。研究结果体外实验：1.人脂肪干细胞可以在明胶微冰胶中铺展生长,接种于明胶微冰胶(GMs)的接种率为65%,与初始细胞密度关系不大。2.人脂肪干细胞以高密度(1×107/ml)接种于GMs时,三维培养组增殖率与二维培养类似。3.当细胞凋亡诱导剂H202浓度在200gmol/L时,两组细胞凋亡无显著性差异；浓度增至500μmol/L,三维培养组细胞抗凋亡作用明显好于传统二维组,差异存在统计学意义(P<0.05)。4.与二维培养相比,hASCs干性相关基因OCT4及Nanog表达在接种到三维材料2h、12h均有统计学差异(P<0.05)；SOX2表达在2h时差异存在统计学意义(P<0.05)。5.三维培养组和普通二维培养组接种24h及48h后,hASCs细胞生长因子基因VEGF及bFGF的表达均有显著性差异；接种48h后,PDGF-bb的表达有显著性差异；而两组间EGF的表达则无显著性差异。ELISA法检测,培养48h、60及72h后,VEGF的表达均有显著性差异；培养72h后,PDGF-bb的表达有显著性差异；培养48h后,bFGF的表达有显著系差异；培养72h后,两组间EGF的分泌有显著性差异(P<0.05)。体内实验：1.创面愈合方面,通过统计愈合曲线,发现GMs+Cells组愈合时间最短(与其余三组差异均存在统计学意义),Cells组愈合时间次之(与GMs组和sham组存在统计学意义),而GMs组和Sham组愈合时间最长(二组无统计学差异)。活体成像观察显示,GMs+Cells组细胞荧光信号多于Cells组,第3d和第6d荧光信号存在统计学意义。2.术后第11d标本免疫组化显示,GMs+Cells组CD31、CK14、PCNA表达均增加。研究结论1.人脂肪干细胞可稳定接种于明胶微冰胶材料,接种后细胞可稳定增殖,抗诱导凋亡能力增强,干性基因(OCT4、SOX2和Nanog)表达在GMs中经历升高然后降低至与二维培养无异的过程,细胞生长因子VEGF、EGF、bFGF、FDGFbb在基因和蛋白水平的表达均上调。因而,是一种优秀的可注射三维细胞培养材料。2.明胶微冰胶复合人脂肪干细胞移植治疗后,可促进裸鼠全层皮肤缺损愈合,增加细胞存活率和存活时间,增加CK14、PCNA表达。