基于QCM生物传感器技术的生物芯片的研制及应用

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石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)生物传感器具有实时监测并且无需标记的优势,已被广泛应用于生物技术、环境监测、药物研发、疾病诊断和食品安全检测等多个领域。在QCM传感芯片表面进行不同的修饰,可形成与目标分子互相作用的功能化表面,使生命科学研究中的分析过程集成在传感芯片上完成,是检测技术的核心。通过QCM传感芯片实现对蛋白质、糖类、凝集素及其他生物组分快速高效的处理和分析,对于生命科学的发展具有重大的意义。本研究分别制备了QCM三维羧甲基化葡聚糖芯片、三维支链糖芯片、聚多巴胺(PDA)糖芯片和细胞芯片。1)本研究分别用分子量为100kDa、500kDa和2000kDa的葡聚糖制备了三维羧甲基化葡聚糖芯片。为了研究不同的芯片固定蛋白的能力,基于QCM生物传感器技术,二维羧基芯片和三维羧甲基化葡聚糖芯片分别用于Anti-h myoglobin 7005蛋白的固定并用于蛋白-蛋白相互作用的研究。结果表明,分子量2000kDa的葡聚糖制备的三维芯片固定的蛋白量是二维芯片的4倍多,是分子量500kDa的葡聚糖制备的三维芯片固定蛋白量的2倍多。而且三维羧甲基化葡聚糖芯片表面经过10次的再生后依然具有较高的生物活性。最重要的是,我们用二维芯片和不同分子量的葡聚糖制备的三维芯片检测了分子量为0.67kDa的小分子核苷酸,结果显示,二维芯片和分子量100kDa的葡聚糖制备的三维芯片检测不到小分子核苷酸,分子量500kDa的葡聚糖制备的三维芯片有2.5Hz的响应值,但是分子量2000kDa的葡聚糖制备的三维芯片却有8.1 Hz的响应值。结果表明,分子量2000kDa的葡聚糖制备的三维芯片在蛋白和小分子药物的相互作用的研究中展示出很大的应用潜力。2)本研究制备了一种通用高效的QCM三维支链糖芯片。利用全氟苯基叠氮化合物(PFPA)的光照插入反应和酰胺化反应,将树枝状末端含有炔基的分子固定在裸金芯片表面,利用叠氮-炔的点击化学反应将两种不同的糖分子修饰在芯片表面,制备了树枝状的三维甘露糖芯片和半乳糖芯片,同时用同样的化学修饰方法制备了直链的二维甘露糖芯片和半乳糖芯片。基于QCM生物传感器技术,分别用于检测糖与凝集素的特异性相互作用。相比于二维直链糖芯片,三维支链糖芯片表面有更多的特异性结合位点,显示出显著的“糖簇效应”,检测凝集素的信号强度有较大的提高。经过多次芯片表面的再生,三维支链糖芯片表面依然具有较高的活性。3)本研究制备了一种新型的基于QCM生物传感器的PDA糖芯片,用于检测其与凝集素的相互作用。制备过程只需先将QCM裸金芯片浸入到p H 8.5的多巴胺溶液中一段时间,便可在芯片表面包被一层PDA的薄膜。利用氨基与PDA的Michael加成或Schiff碱反应,将末端含有氨基的糖分子固定在包被了PDA薄膜的芯片表面,即制得PDA糖芯片。该芯片制备方法简单,反应条件快速且温和。利用所制备的PDA糖芯片,分别检测甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺与五种凝集素的特异性相互作用,并且对凝集素ConA与甘露糖的相互作用的动力学进行了研究。经过多次芯片表面的再生,PDA糖芯片表面依然具有较高的活性,而且该芯片经过简单的清洗便可使其恢复至裸金芯片。芯片可重复用来修饰,提高了QCM生物传感器的实验效率,降低了实验成本。本研究提供了一种简单通用的糖芯片的制备方法,对QCM生物传感器的广泛应用及生物分子相互作用的研究具有重要意义。4)本研究制备了一种通用的基于QCM生物传感器的细胞芯片,首先合成了含有短链乙二醇和生物素的化合物,用此化合物培养细胞,将链霉亲和素共价修饰到QCM羧基芯片表面,利用生物素与链霉亲和素之间的特异性作用固定细胞,制备了细胞芯片。此方法无论在玻璃片表面还是QCM芯片表面都适用,既可以制备贴壁细胞芯片,也可以制备悬浮细胞芯片。基于QCM生物传感器技术,实时检测了一系列凝集素与人急性淋巴白血病细胞(Jurkat)表面糖的相互作用,为细胞表面糖基化的研究提供了一个方便高效的新方法。
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