黄喉拟水龟是在亚洲曾广泛分布的龟类动物,而目前处于濒危状态。由于其较高的食用、药用和观赏价值,黄喉拟水龟养殖业发展迅速。然而对其种质资源的研究薄弱,其主要种群的遗传多样性和遗传结构不清晰,且其与近缘种安南龟的分类关系一直未能很好的解决。本研究针对黄喉拟水龟种质资源研究中的主要问题,从形态、微卫星标记、线粒体和核基因的不同水平上对黄喉拟水龟遗传资源进行评估,并安南龟与黄喉拟水龟各种群的遗传关系进行了探讨。1.黄喉拟水龟不同种群的形态变异分析本研究收集黄喉拟水龟4个不同种群的初孵稚龟,在相同环境下养殖至300g左右,进行几何形态分析。发现北方种群与台湾种群相近,南方种群与海南种群相近,而南方龟与北方龟存在较大的差异。台湾种群与北方种群也存在微弱的差异,并可通过主成分分析和判别分析区分开,说明台湾种群与北方种群也存在一定的地理隔离,从而形成了独有的种质特征。南方种群与海南种群差异较小,多数指标均不能明确分开。本研究还发现背甲和腹甲的变异程度是不同的,背甲对不同种群的辨别能力更强,而腹甲则较弱。2.黄喉拟水龟不同种群的微卫星变异分析利用微卫星分子标记对黄喉拟水龟4个主要种群的遗传多样性和遗传结构进行分析。黄喉拟水龟4个种群的期望杂合度为0.7260到0.7862,遗传多样性丰富,其较高的遗传多样性为黄喉拟水龟的选育提供了丰富的种质资源。4个群体间存在显著的遗传分化。其中南方群体和海南群体关系最近,遗传距离仅0.352,且在散点图上有一定重叠,而与北方种群和台湾种群距离较远,北方种群和台湾种群虽然关系较近,但能够完全分开,说明遗传分化较大。进化树表明南方种群和海南种群形成一支,而北方种群和台湾种群形成另一支,与地理分布一致。3.利用线粒体和核基因探讨黄喉拟水龟不同种群与安南龟的进化关系测定黄喉拟水龟4个种群和安南龟的3个线粒体基因序列和2个核基因序列,并进行进化分析。发现线粒体基因的进化速率较快,而核基因进化速度则慢的多,证明线粒体基因组是独立于核基因组之外独自进化的,而龟类线粒体的进化速率慢于其他脊椎动物。黄喉拟水龟的DNA条形码基因COI序列种群间的遗传差异为5.3-6.7%,安南龟与黄喉拟水龟南方种群和海南种群差异小,说明安南龟与黄喉拟水龟南方种群属同一母系来源。海南种群与南方种群未发现明显进化分支,为同一类群,但北方种群与台湾种群存在较明显分化,两个种群形成各自一支,说明台湾种群与大陆的北方种群隔离时间较长。这与其形态和个体大小方面的差异是一致的。在进行物种保护时应予以特别关注,台湾种群应作为单独的保护单元开展保护。基于核基因R35和RAG1研究安南龟与黄喉拟水龟的遗传关系,得出不同的结果,其中R35基因与线粒体分析结果相反,而RAG1基因则支持线粒体基因的分析结果,这说明使用单一基因对进化关系的界定有其局限性。核基因组相对线粒体基因组大得多,所以需要对核基因进行更多的研究,才能得出相对准确的结果。4.黄喉拟水龟各种群及安南龟的线粒体全序列测定及多态性分析测定了黄喉拟水龟北方种群、台湾种群、南方种群及安南龟的线粒体全序列。全序列最短为南方种群16494bp,最长为北方种群16758bp,与其他龟鳖类差别不大。在t RNALeu与16Sr RNA基因间存在35-36bp的间隔,t RNACys和t RNAAsn间也存在26-27bp间隔,其他基因间也有-10-12bp不等的间隔或重叠。编码蛋白质的基因中COI基因的起始密码子为GTG,其他蛋白都以ATG为起始密码子,结束密码子为TAA,而ND1、COI、COX、ND3四个基因以T为结束密码子。黄喉拟水龟北方种群线粒体DNA序列D-Loop区存在一个长串联重复区(Variable Number of Tandem Repeats,VNTR)微卫星序列,重复序列为(TTATTATA)30,中间被一个(TTATA)和(TTAAG)隔开。而南方种群、台湾种群及安南龟却仅有3-7次重复,说明黄喉拟水龟和安南龟线粒体中的微卫星变异非常大,具有明显的个体差异,可作为黄喉拟水龟的分子标记。通过进化树构建,黄喉拟水龟北方种群与台湾种群关系最近,而南方种群与安南龟关系更近,与前期研究一致。然而通过K2P距离来看,安南龟与南方种群的距离与南方种群与北方种群的距离差别不大,均为0.35左右。这说明南方种群和安南龟的线粒体DNA也有一定的分化,只是以往研究中分析的片断未能表现出来。这也进一步说明线粒体不同区域的进化速率存在较大差异,目前所采用的COI、12S、Cytb及ND4序列相对保守,其变异率相对较低。而使用线粒体全序列能够检测到较近的分化事件。5.利用简化基因组测序分析黄喉拟水龟各种群与安南龟的关系本研究利用RADSeq技术对黄喉拟水龟4个地理种群和1个安南龟种群进行测序,经过拼接,获得5.5M bp共同序列,占基因组约0.25%,其中多态位点243292个,简约信息位点63211个。黄喉拟水龟4个种群中,海南和南方种群的独有的SNP位点较少,而北方种群和台湾种群相对较多,这与其线粒体DNA中碱基多样性相反,说明线粒体的多样性与核基因的多样性信息并不一致,南方种群和海南种群的建群群体中母龟个体来源单一。安南龟群体中独有的SNP和插入/缺失位点明显多于黄喉拟水龟各群体,超出约1倍,这说明安南龟种群的变异度明显高于黄喉拟水龟各种群。利用共有序列构建ML、MP和NJ进化树,表明安南龟与海南种群黄喉拟水龟的关系较近,支持线粒体及部分核基因的结果。而基于少数基因的结果不一致可能是因为不同基因在进化中的进化模式不同,出现趋同进化或趋异进化,从而出现互相矛盾的结果。RADSeq测序所产生的SNPs标记在基因组中分布均匀,数量庞大,是构建遗传进化树的理想数据来源。本研究从中鉴定出大量SNP、插入/缺失位点和微卫星标记,对于了解黄喉拟水龟的种群遗传具有较高的参考价值。6.黄喉拟水龟脑-性腺的转录组分析研究本研究首次完成黄喉拟水龟脑-性腺的转录组测序,从中鉴定了大量功能基因、分子标记,特别是与与繁殖活动包括性腺发育、生殖细胞分化、成熟、排卵、交配等相关的基因共598个,从中鉴定出SNP标记7007个,插入/缺失位点980个,微卫星位点153个,这些基因和分子标记为黄喉拟水龟种质资源发掘和高繁殖力品系选育奠定了基础。通过对黄喉拟水龟雌雄性成熟个体脑-性腺组织转录组的测序,发现雌性差异表达基因1439个,其中雄性高表达基因549个基因,雌性高表达基因890个,表达差异基因包括细胞周期、卵细胞减数分裂、DNA以及细胞结合分子、细胞外基质受体相互作用和焦点粘连等相关基因。这些基因对研究黄喉拟水龟雌雄分化的机制提供了资料。