研究背景胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是成人最常见的侵袭性的原发性脑恶性肿瘤。其治疗方案首选手术切除,术中要求尽可能多切除肿瘤,术后局部放射治疗和化疗。目前化疗药物通常使用的是替莫唑胺,一种口服的DNA烷基化剂,它与术后放疗联合使用,使患者的生存期从12.1个月增加到14.6个月。然而,至少50%的GBM患者对替莫唑胺的治疗不敏感。GBM的肿瘤生物学特性使该疾病对治疗具有抵抗性。首先,GBM肿瘤边缘的细胞浸润生长于正常脑组织,使手术完全切除肿瘤成为不可解决的难点。其次,由于脑内血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的存在,大多数化疗药物分子无法充分渗透到大脑组织中发挥有效的治疗作用。第三,由于GBM具有高度的细胞、遗传异质性,靶向关键分子途径的治疗通常无效。因此,GBM的治疗迫切需要新的有效药物和治疗靶点。药物再利用已经成为一种被广泛接受的肿瘤治疗策略,通常使用对特定疾病疗效明确且安全性较好的药物去治疗其它疾病,以确定新的疗法或者获得更好的治疗效果。目前已知对人体相对安全的药物可以快速的应用于临床试验,尤其是针对治疗选择很少的肿瘤疾病。例如,氟苯达唑和甲苯达唑,作为苯并咪唑氨基甲酸酯家族中的化合物,被批准用为驱虫药。而近几年有研究表明,这类药物对包括人类神经胶质瘤在内的多种肿瘤,具有抗肿瘤特性。例如,在已有研究中,氟苯达唑已被证明可抑制胶质瘤增殖。在同种和异种原位胶质瘤小鼠模型中,甲苯达唑被证明对胶质瘤具有细胞毒性,显著延长了小鼠平均生存期。而且甲苯咪唑已经被应用在1期临床试验中,在剂量达200 mg/kg时显示出长期的安全性和可接受的毒性。作为苯并咪唑化合物家族中的一员,噻苯达唑（TBZ;thiabendazole;tiabendazole;2-（thiazol-4-yl）benzimidazole）已经被用于治疗人类肠道寄生虫超过50年。TBZ可抑制白色念珠菌、青霉菌,帮助治疗银屑病,防止植物饲料中黄曲霉毒素的形成,且无致癌特性,也不影响动物的生育能力。此前的一项研究表明,TBZ可降低人类纤维肉瘤的生长。因此,TBZ作为一种相对安全的苯并咪唑化合物家族的成员,其抗癌治疗的潜力引起了我们的关注。GBM与其它高恶性实体肿瘤相似,其细胞表现出异常的增殖和细胞周期循环,这与其细胞周期的调控蛋白表达失调有关。因此,基于GBM的这一生物学特点为治疗靶点的放疗和化疗方案得已确立。有丝分裂障碍是指由各种刺激引起的异常有丝分裂。有丝分裂障碍通过诱导有丝分裂相关的永久细胞周期阻滞而最终导致细胞死亡。已有多个研究报道,在体外咪唑类药物可诱导肿瘤细胞有丝分裂障碍,产生多倍体、非整倍体,上调自噬,并通过凋亡或坏死途径死亡。在本研究中,我们研究了 TBZ对GBM细胞的体外和体内抗癌作用及其分子机制。TBZ可以诱导GBM细胞周期G2/M期阻滞,进而抑制增殖,并且TBZ可以抑制GBM侵袭。我们对TBZ处理的肿瘤细胞进行RNA测序,鉴定差异表达基因,发现微染色体维持蛋白 2（mini-chromosome maintenance protein 2,MCM2）、核仁和纺锤体相关蛋白 1（Nucleolar and spindle associated protein 1,NUSAP1）在 TBZ 处理的胶质瘤标本中显著下调,并详细探讨了 MCM2、NUSAP1作用机制。这些结果支持了 TBZ辅助治疗GBM的可能性。第一部分噻苯达唑靶向MCM2抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭研究目的本研究在体外细胞模型和体内异种肿瘤种植动物模型上,应用噻苯达唑（TBZ）对胶质母细胞瘤细胞系进行治疗。通过观察胶质母细胞瘤细胞系的肿瘤行为改变以及检测其细胞内相关分子表变化,验证噻苯达唑对胶质母细胞瘤细胞的抑制作用。研究方法1.人胶质母细胞瘤细胞系体外培养。2.CCK-8（cell counting kit 8）检测胶质母细胞瘤细胞系的细胞活力及用药后的变化。克隆形成实验检测胶质母细胞瘤增殖的变化。应用EdU试剂检测胶质母细胞瘤细胞系的细胞复制分裂的情况。3.Trans-well小室内种植胶质母细胞瘤细胞,观察用药后细胞透过数量改变情况,评估噻苯达唑对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。构建三维肿瘤球后,观察基质胶内从肿瘤球向外侵袭的细胞范围,判断噻苯达唑对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。肿瘤球与类脑器官共培养观察肿瘤细胞侵蚀类脑器官的程度和速度,检测噻苯达唑作用前后,胶质母细胞瘤侵袭能力的变化。4.应用蛋白质免疫印记技术对噻苯达唑作用后细胞增殖（PCNA）、细胞周期（Cyclin B1,Cyclin B2,CDK1）、肿瘤细胞侵袭（ZEB1,N-cadherin,MMP2）相关的重要蛋白质进行检测,验证药物作用后对胶质母细胞瘤增殖、侵袭能力的影响。5.噻苯达唑治疗2天后,将从细胞分离的RNA进行RNA测序,进一步分析噻苯达唑作用下细胞内RNA表达变化情况。对有差异表达的基因进行生物信息分析,通过GO和KEGG富集分析发现表达差异显著的通路和分子,经过蛋白质相互作用网络分析筛选与其它蛋白作用频繁的关键蛋白,最终寻找噻苯达唑对胶质母细胞瘤潜在的作用靶点。6.利用小干扰RNA转染技术,作用于目标分子MCM2,降低其蛋白表达量,检测靶蛋白在胶质母细胞瘤细胞系中对细胞增殖、侵袭的影响。7.构建目标蛋白的过表达病毒,并感染胶质母细胞瘤细胞系,建立MCM2稳定过表达的细胞系,进一步验证MCM2在胶质母细胞瘤细胞系中作用,并检测在噻苯达唑作用下,MCM2过表达后,胶质母细胞瘤细胞系受到的增殖、侵袭抑制是否得到缓解。8.P3细胞异种种植在裸鼠脑内,并以腹腔注射的方式每日给予裸鼠噻苯达唑药物,观察药物对体内胶质母细胞瘤的作用。研究结果1.噻苯达唑在体外实验中可以明确对胶质母细胞瘤细胞系（P3,U251,LN229,A172,U118MG）起增殖抑制作用,其抑制效果随浓度增大而变强。人星形细胞系细胞（normal human astrocyte,NHA）的IC50比肿瘤细胞高,对噻苯达唑的毒性作用有一定抵抗力。噻苯达唑对P3和U251细胞的增殖抑制呈计量和时间依赖性,并可诱导出P3和U251细胞系的细胞周期G2/M期阻滞,下调增殖及细胞周期调控的相关蛋白质表达量,抑制P3和U251细胞增殖。2.根据Trans-well侵袭实验和三维侵袭球实验结果,噻苯达唑对胶质母细胞瘤细胞系P3和U251的侵袭起抑制作用,侵袭相关的蛋白表达量下调,且高药物浓度处理组（TBZ 300μM）抑制效果更显著。类脑器官侵袭实验结果显示,噻苯达唑可以抑制P3肿瘤球侵蚀类脑器官的程度和速度。3.根据加药组和未加药组的P3、U251细胞系进行RNA测序结果,对胶质母细胞瘤中差异表达的基因的数据进行生物信息学分析,发现细胞周期、有丝分裂相关基因表达差异最明显。在P3、U251细胞系中,表达量下调差异均位于前十的三个基因为MCM2、UHRF1、MCM5,其中经蛋白质免疫印记法检测,MCM2的蛋白质表达水平下调最显著。4.MCM2下调后,P3和U251细胞增殖减弱,出现细胞周期G2/M期阻滞,细胞增殖相关蛋白和细胞周期相关蛋白质表达量下调。并且,MCM2下调后,P3和U251细胞侵袭能力减弱,侵袭相关蛋白表达下调。5.MCM2过表达后,P3和U251细胞增殖能力变强,噻苯达唑使用带来的G2/M期抑制减弱,噻苯达唑导致的侵袭抑制得到缓解。细胞周期、细胞增殖以及细胞侵袭的相关蛋白表达量升高。6.经过噻苯达唑治疗,裸鼠颅内肿瘤细胞的增殖被抑制,裸鼠生存时间得到延长,肿瘤组织中MCM2表达量下降。7.MCM2与多种基因相关性的分析中,NUSAP1与其具有较高的相关性,且噻苯达唑可以抑制P3和U251细胞中NUSAP1的表达。研究结论噻苯达唑可以抑制胶质母细胞瘤细胞系P3和U251的细胞增殖、细胞侵袭。经过对RNA测序结果分析,MCM2是噻苯达唑治疗的重要靶点。因此,对于胶质母细胞瘤,该药物提供了一种新的辅助治疗策略。第二部分NUSAP1敲减通过下调人胶质母细胞瘤中TOP2A基因水平抑制细胞增殖和侵袭研究目的研究核仁纺锤体相关蛋白 1（Nucleo1ar And Spindle Associated Protein 1,NUSAP1）在胶质瘤中的表达和作用,以及对患者生存的影响;进一步探究NUSAP1相关的下游调控基因,为胶质瘤提供新的治疗靶点。研究方法1.在TCGA、CGGA、REMBRANT数据库中分析NUSAP1的表达情况及患者生存情况。2.采用免疫组化技术和蛋白质免疫沉淀法,检测本院收集的胶质母细胞瘤组织标本中NUSAP1表达量。3.EdU试剂检测细胞复制增殖情况。4.Trans-well侵袭实验检测细胞侵袭变化情况。5.使用PI和Annexin-V双荧光染色,在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。6.利用小干扰RNA转染技术,下调NUSAP1、TOP2A的蛋白表达量,检测其蛋白在胶质母细胞瘤细胞系中的作用。7.RNA测序以及生物信息分析确定NUSAP1下游调控基因。8.P3和U251细胞异种种植在裸鼠脑内,观察NUSAP1表达下调后,体内胶质母细胞瘤的增值变化情况。研究结果1.NUSAP1在高级别胶质瘤中表达上调,并与胶质瘤患者的预后呈负相关。在本院收集的胶质瘤标本中,NUSAP1表达量随肿瘤级别升高而升高。NUSAP1在胶质母细胞瘤细胞系U251、T98、P3中表达量较高。2.下调NUSAP1后,EdU实验结果显示胶质瘤细胞增殖减少,Trans-well实验结果显示胶质母细胞瘤的侵袭细胞数量减少,PI和Annexin-V双荧光染色可见细胞凋亡增加。3.对RNA测序结果分析,NUSAP1下调后,8个基因（MT1F,S1PR1,IGFN1,UTP14C,TOP2A,KRT6A,ANO1,UFSP1）表达随之下调。其中TOP2A表达差异明显,且在蛋白互作网络分析中与NUSAP1存在潜在相互作用关系。并且NUSAP1的下调显著抑制了胶质母细胞瘤细胞中TOP2A的蛋白表达水平。4.TOP2A表达下调与NUSAP1表达下调效果相似,显著抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭和诱导细胞凋亡。5.在体内下调NUSAP1可抑制TOP2A的表达,抑制胶质瘤的生长和侵袭。研究结论NUSAP1被敲减后,胶质母细胞瘤细胞增殖侵袭能力下降,细胞凋亡增加。NUSAP1通过下调TOP2A基因的表达,抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和诱导细胞凋亡。本研究为通过沉默NUSAP1介导的胶质母细胞瘤抑制机制提供了新的见解,NUSAP1可以作为潜在的生物靶点治疗恶性脑肿瘤。