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目的:通过建立体内外实验模型研究加味肾康方对Wnt/β-catenin信号通路相关因子Wnt4、β-catenin及纤维化相关因子α-SMA、Vimentin、E-Cadherin的影响,探讨加味肾康方在抗肾纤维化中的现代生物学分子机制,以求为中医药防治肾纤维化提供实验依据。实验一:加味肾康方在UUO大鼠肾间质纤维化Wnt/β-catenin信号通路中的作用及机制研究方法:1.造模与分组:将126只SPF级雄性SD大鼠,随机分为7组,每组18只,适应性喂养7天后,分为空白组、假手术组、UUO模型组、贝那普利组、加味肾康方低剂量组、加味肾康方中剂量组、加味肾康方高剂量组。除空白组、假手术组外,假手术仅轻触输尿管后关腹,其余各组均复制UUO模型,从术后第三天开始灌胃给药,空白组、假手术组、模型组以蒸馏水灌胃,其余各组按相应药物进行灌胃。2.标本采集与检测:分别于术后第7天、14天和21天每组随机选择6只大鼠取样后处死,观测各组大鼠的一般情况,以及留取左肾标本以备观察,分析测定血清中的尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、行肾组织HE（hematoxylin-eosin staining）及马松（Masson）染色观察病理形态学改变,采用免疫组织化学法半定量分析肾组织Wnt4、β-catenin和α-SMA的变化。结果:1.各组大鼠的一般情况及死亡情况:在整个实验过程中,空白组和假手术组大鼠精神饱满,反应敏捷,动作灵活,皮毛顺滑有光泽,饮食二便饮均正常,体重逐渐增加;随着时间的延长,模型组、贝那普利组、加味肾康方高中低各组大鼠逐渐出现精神不振,反应迟滞,皮毛干枯毛躁,出现食欲减退,大便稀溏,体重增长减慢等现象。与UUO模型组相较,贝那普利组与加味肾康方各组大鼠状态均优于模型组,各治疗组对大鼠的一般情况均有改善。其中高剂量组有一只大鼠在实验后期因意外死亡造成样本脱落一例。2.生化指标检测结果:在7天时,与UUO模型组比较,各治疗组的BUN均出现下降（P＜0.05）有统计学意义。在其余时间段,与UUO模型组比较,各治疗组BUN指标无明显差异（P＞0.05）。在7、14天时,与空白组比较,UUO模型组Scr有升高波动,但无统计学差异（P＞0.05）;与UUO模型组比较,各治疗组Scr均无统计学差异（P＞0.05）。在21天时,与空白组比较,UUO模型组Scr出现升高,有统计学意义（P＜0.05）。与UUO模型组比较,贝那普利组Scr出现下降（P＜0.05）。3.肾脏组织病理学结果:HE染色显示空白组、假手术组大鼠肾小球、肾小管及间质均未见萎缩、炎性浸润等病变。与UUO模型组比较,加味肾康方各治疗组、贝那普利组亦表现出肾小管管腔扩张、上皮细胞变形和炎性细胞浸润,明显有所改善。Masson染色显示空白组、假手术组仅肾小球的基底膜及系膜区偶见少量蓝色胶原沉积,在各个时间点,与UUO模型组比较,加味肾康方各组、贝那普利组蓝染胶原沉积有所减少。4.免疫组织化学结果:空白组、假手术组无明显病理改变,UUO模型组中可见Wnt4、β-catenin均呈明显的表达升高。与UUO模型组比较,加味肾康方各治疗组、贝那普利组的Wnt4、β-catenin表达均有降低（P＜0.05）。与UUO模型组比较,第14、21天时,加味肾康方各治疗组、贝那普利组α-SMA的表达减少（P＜0.05）。实验二:加味肾康方对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化中Wnt/β-catenin信号通路的干预及机制研究方法:1.血清制备与造模分组:将20只SPF级雄性大鼠随机分为4组后,每组各5只。空白组以生理盐水灌胃,其余各组按加味肾康方高、中、低剂量组给予灌胃,用以制备大鼠含药血清及正常大鼠血清。采用CCK-8法将制备好的大鼠含药血清作为药物源加入到体外培养的HK-2细胞中,检测其对HK-2细胞的增殖情况的影响,筛选合适浓度进行后续实验。继而采用10ng/m L转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激细胞,分别在15、24、48、72 h后,通过实时荧光定量（RT-qPCR）检测出各时间点E-cadherin和Vimentin m RNA的表达情况,确定最适时间建立HK-2细胞转分化为肌成纤维细胞的细胞模型。其后分为以下四组:对照组、TGF-β1组、中药治疗组（TGF-β1+加味肾康方含药血清组）、单纯含药血清组（加味肾康方含药血清组）进行实验。2.采用RT-qPCR法分别检测四组中Wnt4、β-catenin、Vimentin、E-Cadherin m RNA的表达水平。结果:1.加味肾康方高、中、低剂量组含药血清均对HK-2细胞的增殖无影响,随机选取高剂量组含药血清进行实验,经10ng/m L TGF-β1刺激HK-2细胞48 h后,EMT细胞模型建立成功。2.与模型组比较,加味肾康方含药血清治疗组能显著下调Wnt4、β-catenin、Vimentin m RNA的表达水平,有统计学差异（P＜0.05）,并上调E-Cadherin m RNA的表达水平,有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.加味肾康方能改善UUO大鼠的生存状态,减轻肾脏病理变化,并与贝那普利作用相当。其机制可能是通过下调Wnt4、β-catenin及α-SMA的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,起到延缓肾间质纤维化的作用。2.加味肾康方可能是通过下调Wnt4、β-catenin、Vimentin m RNA的表达,上调E-Cadherin m RNA的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路活化,达到拮抗肾小管上皮细胞转分化的作用。