研究背景作为一种恶性的成骨性肿瘤,骨肉瘤的主要来源是骨组织,通常其多见于骨生长活跃的年轻人当中,由于其恶性程度高,侵犯范围较大,而且容易发生早期肺部的转移,因此往往治愈难度大,过去单一治疗效果不够理想,五年内存活率不足两成,尽管有关新辅助化疗以及保肢手术的探究日益深化,愈来愈多的骨肉瘤病患能够保留自身的肢体,延续自己的生命年限。但是在诊断方面,到目前仍然没有可识别性标志物,在骨肉瘤分化比较差的时候仅仅通过观察形态来作出诊断,因此病理判断的精确性不够。同时肿瘤的复发和转移等恶性生物学行为仍然是很大程度上影响着患者的预后、导致骨肉瘤患者生存率不理想,进而导致骨肉瘤患者治疗失败的主要因素。目前相关的基础研究对骨肉瘤病因及转移发展机制仍未有重要的突破,在临床上也没有新的药物和新的治疗模式产生,因此寻找新的研究突破点、探讨人骨肉瘤的侵袭和转移机制显得至关重要。既往针对肿瘤细胞的杀伤主要包括化疗和放疗介导的细胞凋亡,而这正是由肿瘤细胞可以抑制自身凋亡、促进自身存活力增强的共同特征所决定的。正常细胞的凋亡机制受到抑制导致肿瘤的发生,而肿瘤细胞的凋亡机制紊乱导致肿瘤的不断增殖是困扰和限制临床治疗及肿瘤基础学研究进一步发展的核心问题。究其根本,包括IAPs家族在内的多种凋亡抑制基因参与其中、相互协调作用是该问题的关键。IAPs家族负责编码一组结构相似、功能相关的蛋白,这一家族的大多数成员可以借助直观层面的联合与阻止特定的Caspase来抑制细胞凋亡,是调控启动Caspase和效应Caspase的唯一内源性蛋白。迄今为止,在人体新发现的IAPs家族有8个成员,即NAIP、XIAP(ILP-1/MIHA)、cIAP-1(HIAP-2/MIHB)、Survivin(TIAP)、Apollon(Bruce)、cIAP-2(HIAP-1/MI-HC)、ILP-2(Ts-IAP)与Livin(ML-IAP/KIAP)。其中Survivin是近几年发现的一个IAPs家族中的成员,因其在正常人体的组织内均无明显表达,而在恶性肿瘤组织中呈特异性高表达,因此将Survivin作为连接细胞凋亡和细胞周期的纽带,同时作为促进骨肉瘤细胞凋亡、治疗骨肉瘤组织生长的针对性靶点是我们未来研究骨肉瘤靶向疗法的潜在性突破口和该领域研究的热点。Survivin基因由Ambrosini等借助ECPR1内的cDNA自人类基因库内选取,该基因全长15kb,其位置在17q25染色体上,存在的外显子数量是4个,内含子的数量是3个,在进行一定的编码程序以后,就会产生内含142个氨基酸的Survivin蛋白,有别于IAP家族的其他成员,截止到目前,Survivin不仅是家族中最新发现,也是分子量最低的凋亡抑制蛋白。因此其在功能上也一定程度的有别于IAP家族的其他成员,即:干预细胞凋亡的同时也参与细胞有丝分裂及其他细胞阶段性的周期变化,还在肿瘤滋养血管出现和转移性生长进入其它器官的过程中发挥作用:(1)遏制细胞凋亡的功效:①Survivin借助BIR功能区的妨碍凋亡相关的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84直接作用于Caspase-3、Caspase-7,在干扰他们活力的同时可以进一步起到干扰凋亡的作用。②Survivin借助和细胞附件控制因子CDK4产生Survivin-CDK4,这种混合产物可以使P21自CDK4内能够被释放出来,而P21可以和Caspase-3发生关联,进而能够对Caspase产生一定的约束性,防止细胞出现凋敝的情况。③近几年研究指出,Survivin是周期蛋白激酶p34cdc-cyclinBl在有丝分裂阶段中形成的底物,磷酸化Survivin Thr34之后可以再和Caspase-9发生关联,防止依赖于Caspase-9发挥作用的相关细胞凋亡因子的转导传输。(2)调节细胞周期的功效:Survivin与CDK4结合后,竞争性地抑制CDK4/p16(INK4a)复合物的形成,活化CDK2/cyclin E,磷酸化Rb,从而加快G1期向S期的转换。在G2/M期特异性表达,Survivin因其羧基末端无RING锌指结构,代之以一个长度为6.5nm、由40个氨基酸组成的α螺旋结构,在有丝分裂的初期,Survivin借助这一架构和有丝分裂纺锤体内存在的microtubule结构发生特定可饱和作用,加速有丝分裂、促进恶性肿瘤细胞繁殖的同时避免因先天遗传或后天突变引起的细胞自然或非自然死亡。(3)参与血管形成的功效:VEGF在肿瘤组织中可以导致肿瘤滋养血管的生成,而Survivin在该过程中具有保障血管内皮组织与新生血管出现的关键价值。0’ Connor等指出血管内皮细胞中的Survivin可以在VEGF与bFGF的介导下较呈现高表达状态。Tran等分析认为,在稳定细小血管网架构、保障血管内皮细胞性能、使肿瘤血管内皮细胞产生化疗药物耐药性等方面,Survivin均发挥了一定的作用。Coma等制备了针对Survivin的反义寡核苷酸,在沉默Survivin的表达后发现由TNF介导的VEGF的抗凋亡活性降低,而Survivin的表达与VEGF的表达又呈正相关,提示二者在骨肉瘤的血管生成过程中发挥协同作用。由此可见,肿瘤尤其是骨肉瘤的发生、发展及转移的确是一个十分复杂的过程,目前骨肉瘤发生及转移原因尚未得到阐明。细胞凋亡作为一种高度保守的细胞死亡机制,又被称为程序性细胞死亡,其具有组织、生化和形态学方面特性。由于肿瘤的生长和发展取决于肿瘤细胞的增殖率与凋亡率之间的平衡,这种平衡一旦打破,一方面,那些在生理状态下需要及依赖于凋亡程序发挥作用的组织内环境稳定性及胚胎细胞发育过程会发生紊乱。而另一方面,干扰细胞的凋亡又能够导致细胞存活时间很大程度延长,基因突变体的聚积从而诱发肿瘤的形成、促进肿瘤转移、增强肿瘤化疗耐药性。因此伴随着肿瘤分子遗传学、分子生物学,特别是靶向肿瘤分子学的进步,找到细胞凋亡机制中作用于骨肉瘤的发生、发展、侵袭、转移全过程的有效靶点是现今从事骨肉瘤研究的学者们迫切希望解决的重中之重。从当前的研究我们能够看出,骨肉瘤组织里的Survivin基因的异常表达有可能促使肿瘤细胞脱离生长监控的范围,克制肿瘤细胞的凋亡。有学者提出,Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。还有的研究利用Cox多变量回归模型展开剖析,对骨肉瘤病患的Survivin表达程度配合化疗前化疗敏感性的预期展开预估,最终得出Survivin蛋白表达的上调同骨肉瘤组织发生发展密切相关,且Survivin可以作为骨肉瘤诊断和判断预后的一个标志物。Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。因为凋亡遏制蛋白Survivin于肿瘤组织中选择性的高表达,我们可以这样进行假设:抑制Survivin有可能导致骨肉瘤细胞的自发性凋亡,我们在既往的实验中证实了在骨肉瘤细胞系U20S、SAOS及MG63中,Survivin的表达明显增加,这在我们后续对比骨肉瘤组织和正常组织中Survivin表达的实验中也得到证实。我们还发现采用Survivin反义寡核苷酸技术可以降低Survivin在骨肉瘤细胞中的表达,显著抑制骨肉瘤细胞增殖并呈现出浓度依赖性,从而诱导骨肉瘤中的细胞凋亡。根据以往研究结果,我们进一步提出假设:是否存在着一种下游信号传导通路元件,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用;而在体内环境中,抑制Survivin又能否影响骨肉瘤瘤体的生长。肿瘤的转移囊括了肿瘤细胞于间质里移动并且接触脉管、肿瘤细胞突破血管内皮还有内皮下的基底膜展开血流,而且在血液里存活、肿瘤细胞穿出血管,于组织里生长、增殖,产生转移灶。因此我们能够看到,肿瘤的转移和细胞之间、细胞同细胞之外基质二者之间的的粘附作用存在一定关系。但是此类相互辨别以及作用是需要CAMs在其中发挥其介导作用的。整个CAMs家族里的一个关键元素即整合素,它是利用非共价键将α以及β两种亚单位链接所组成的的异二聚体分子。根据该家族中当前所发现的二十五个α亚单位以及十一个β亚单位,可以一起构成不下数十种不一样的整合素。这两种亚基构造有相似之处,都是通过较长的胞外段(氨基端)、跨膜段、较短的胞内段(羧基端)三部分一起组成的。α亚基凭借其胞外段能够对于ECM的RGD序列加以辨别,介导细胞与ECM二者的粘附,而β亚基的胞内段同细胞骨架构连接在一起。整合素与配体结合发挥其功能,故整合素按识别配体的不同又可分为三大类,本文所讨论的整合素α 5属于其中识别非RGD序列的整合素,其配体为基底膜蛋白,例如层黏连蛋白(LN)以及纤维连接蛋白(FN)等,而胶原蛋白正是骨组织的主要细胞外基质成分,近来人们发现骨组织中整合素的表达水平对成骨和吸收具有调控作用,提示整合素与很多骨代谢疾病甚至成骨、溶骨病变的病理机制有关。除了介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附,整合素同时具有通过与其配体结合后向细胞内传递信号,进而影响基因的表达,最后影响细胞的增殖代谢、基因转导、凋亡等生物学行为的功能。有文献报道,在整合素α 5和Survivin促进骨肉瘤细胞的增殖作用过程中,Caspase-3均起到介导作用;整合素α5和Survivin有可能直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。三者可能共同参与骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。可见,整合素很有可能对骨肉瘤的生长、发展、侵袭、转移过程产生非常重要的影响,而这种影响是在与Survivin相互协调、相互作用中完成的。当前针对Survivin的敲低或敲除实验为骨肉瘤靶向基因治疗提供了理论依据和方向。而相对于反义寡核苷酸技术来说,RNA干扰技术(RNAi)具有转染效率高、转染效果稳定、特异性强、浓度依赖性好、潜在毒性弱、作用时间充分、维持时间较长、实验准备及操作简便的优点。该项技术是由Fire于1998年首先在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA的过程中发现并证实是一种由dsRNA介导的同源RNA降解过程,已逐渐成为公认的实验技术和治疗手段。其原理是在生物体细胞内,利用具备同源性的dsRNA诱使序列特异的特定基因的沉默,快速的防止目标基因活性。siRNA就是RNAi途径中间的产物,或者说也是RNAi发挥作用的必不可少的因素,现如今应用在现实治疗过程中的siRNA类型基本上有两种:体外形成的RNA干涉片段以及DNA干涉载体。由于前者转染效率还存在RNAi功效的瞬时性程度不够,现在大多数应用DNA载体于细胞里表达siRNA相关技术。杨彤涛等对于Survivin基因的RNA干涉特异性片段进行合成,利用骨肉瘤细胞体外生长还有体内移植成瘤试验,证明Survivin的特异性siRNA能够大大促进骨肉瘤细胞自行凋亡的过程。能够看出在有关骨肉瘤的实验性治疗过程里,RNAi能够对于癌基因的表达加以遏制、对于突变激活的癌基因进行清除、克制基因扩增的同时,还能够克制融合基因表达、克制其他肿瘤有关基因的表达。Zou等利用干扰RNA技术并且应用依泊托苷、阿霉素等有关的化疗药物,能够很明显的克制MG63细胞的产生,提升化疗的敏感程度,实验的结果显示出关于Survivin的干扰RNA技术能够提升化疗的效果,进而降低所使用化疗药物的数量,降低因药物所产生不良反应的发生,实现对骨肉瘤细胞生长的有效抑制,显示出抑制Survivin基因联合化疗治疗骨肉瘤的优越性。综上所述,我们拟进行对Survivin及整合素α 5与骨肉瘤恶性行为特性的关系的研究,评价针对Survivin的干扰RNA技术治疗后骨肉瘤细胞内整合素α 5表达的变化情况;分析Survivin与整合素α 5的上下游调控关系,观察上述治疗手段对骨肉瘤组织体内生长的影响,明确Survivin能否通过整合素α 5产生对骨肉瘤细胞的体外、体内作用,使Survivin-SiRNA及整合素α5特异性抗体成为骨肉瘤靶向治疗的新手段。第一章:针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株的制备及体外验证研究目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株,对比分析转染后Survivin在骨肉瘤细胞中的含量,以验证转染效果。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组(scramble RNA转染)和空白对照组(空脂质体转染),再采用Western blot技术检测三组MG63细胞转染后Survivin蛋白的含量,并进行比较。结果:Western blot检测得出的结果显示出MG63细胞裂解液里具备特异性的Survivin蛋白条带。Survivin-SiRNA能降低MG63细胞内Survivin蛋白的表达,Survivin-SiRNA转染骨肉瘤细胞系MG63后Survivin蛋白的含量相比较于阴性对照组和空白对照组中细胞内Survivin蛋白的含量均是下降的。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显著降低了骨肉瘤MG63细胞中Survivin蛋白的含量,进一步证实了 Survivin-SiRNA可以成功抑制Survivin的表达。该转染细胞株的制备为的后续体外细胞学及体内组织学实验积累了相关经验,奠定了理论基础。第二章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组(scramble RNA转染),再采用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。结果:Transwell实验结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,侵袭细胞数显著减少(P<0.01)。而细胞划痕实验结果也显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降(P<0.01)。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显著抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。进一步证实了抑制Survivin的表达可以影响骨肉瘤细胞的发生发展,提示Survivin不仅与骨肉瘤原位生长密切相关,而且可能参与了骨肉瘤远处转移的过程。第三章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5表达水平的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤中整合素α5表达水平的影响,验证整合素α 5是否为Survivin的下游信号传导通路元件。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组(scramble RNA转染),再采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平,并进行比较。结果:通过流式细胞术和荧光显微镜进行观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,整合素α 5的表达水平受到显著抑制(P<0.01)。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显著抑制了骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5的表达水平。进一步证实了针对性抑制Survivin的表达可以下调骨肉瘤细胞中整合素α 5的表达,这说明Survivin可能是整合素α 5的一种上游调节剂,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用。第四章:靶向治疗整合素α 5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的整合素α5-SiRNA转染细胞株,在验证转染效果后探讨整合素α 5-SiRNA以及靶向抗整合素α 5抗体对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向整合素α5的整合素α5-SiRNA对MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组(scrαmble RNA转染),采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平以验证转染效果,之后利用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。再使用靶向抗整合素α 5抗体(M200)作用于骨肉瘤MG63细胞,通过Transwell实验及细胞划痕实验继续观察、比较靶向治疗后MG63细胞的侵袭和迁移能力。结果:Transwell实验结果显示经转染整合素α 5-SiRNA后以及抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞分别与阴性对照组进行比较,发现侵袭细胞数均显著减少(P<0.01)。而细胞划痕实验结果也显示抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降(P<0.01);而阴性对照组在48h内的划痕区域中细胞迁移率甚至超出转染整合素α5-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞的两倍之多(P<0.01)。结论:无论是靶向干扰RNA还是靶向抗体治疗均显著抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。一方面证明了整合素α 5的表达与骨肉瘤细胞侵袭和转移的相关性。另一方面也提示靶向抑制整合素α 5的表达可以直接达到治疗效果,从而为更新骨肉瘤临床治疗方案提供了理论依据。第五章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响目的:将针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株移植到裸鼠体内,建立了骨肉瘤动物模型,观察其体内生长成瘤情况。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组(scramble RNA转染),之后将两组细胞分别接种至裸鼠腹部的左、右两侧皮下。接种三个星期后,处死小鼠并称重肿瘤。观察肿瘤体积,计算肿瘤的平均重量,并进行比较。结果:通过肿瘤称重和肉眼观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞成瘤体积和重量均较阴性对照组明显缩小和下降(P<0.01)。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显著抑制了骨肉瘤MG63细胞的体内生长成瘤情况。进一步证实了抑制Survivin的表达可以减缓异种移植瘤的生长,提示Survivin在骨肉瘤增殖繁衍过程中的重要作用。