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棉铃虫 Helicoverpa armigera(Hubner)(Lepidoptera:Noctuidae)是对多种作物有破坏性影响的世界范围内杂食性害虫之一。中红侧沟茧蜂Microplitis mediator(Haliday)(Hymenoptera:Braconidae)是棉铃虫主要寄生蜂之一,在田间释放可以起到很好的生物防治效果。MicroRNAs(miRNAs)通过与靶基因3’或5’端非编码区内(UTR)的种子区域完全或不完全互补配对导致mRNA的降解、转录受到抑制等来发挥作用。本研究通过探究棉铃虫被中红侧沟茧蜂寄生前后miRNAs的高通量测序分析和差异miRNAs功能研究,希望从miRNAs和寄生蜂两方面为防治棉铃虫的新方法提供新思路,以更好的完善棉铃虫综合防治体系。本研究主要包括以下内容:(1)首先,我们分别以被中红侧沟茧蜂寄生4 d以后以及相同生长时期未被寄生的棉铃虫为样品,采用IlluminaSolexa测序技术构建了棉铃虫的2个miRNA文库。测序结果表明,寄生及未被寄生棉铃虫,其体内测得的sRNA序列长度均在18-26个核苷酸范围内。分析结果显示,寄生前后棉铃虫体内存在多条差异表达的miRNAs。统计结果显示,在P<0.05水平上,显著上调的差异miRNAs有34条,显著下调的差异miRNAs有21条。(2)荧光定量PCR(qRT-PCR)被广泛应用于miRNA的表达研究,合适的内参基因对于结果的准确性至关重要。基于棉铃虫高通量测序结果,选择了棉铃虫体内10条内参基因,在生物因素和非生物因素处理条件下,使用三种内参分析软件(geNorm,NormFinder和Bestkeeper)对所选内参基因稳定性进行了分析,并使用geNorm分析了最适内参基因组合,同时选用了靶基因let-7来进行所选择内参基因的稳定性评估。分析结果显示:生物因素条件下,发育阶段应选择miR-9和U6snRNA作为内参,幼虫组织选择miR-100和U6snRNA,成虫组织使用miR-100和miR-305作为最适内参,寄生处理选用miR-9和miR-279,NPV处理时miR-998和U6 snRNA作为内参最合适。而对于非生物因素处理,农药处理条件下miR-9和U6 snRNA作为内参最稳定,温度处理时可选择miR-92a,miR-100和miR-279,饥饿条件下miR-92a,miR-305和miR-998可被选为内参基因,光照处理时应该选择miR-9和miR-279,而激素处理条件下选择miR-305和miR-998作为内参基因比较合适。因此,不同处理条件下应选择合适内参miRNA以保证实验结果准确性。(3)差异基因之一 miR-133在寄生后的棉铃虫体内显著上调表达,荧光定量和双荧光素酶报告显示,miR-133的靶基因是 Death-associated protein kinase 1(DAPK1)。当上调 miR-133 或者敲除DAPKI后,可以使得未被寄生棉铃虫幼虫体重显著减轻,这种现象与棉铃虫被寄生之后的体型变小趋势相似;而下调miR-133则可以增加未被寄生棉铃虫体重。上调或者下调miR-133表达,未被寄生棉铃虫体内的免疫基因Relish和Dorsal显著上调表达,但被寄生后棉铃虫体内的免疫基因却显著下调表达。因此,miR-133可能通过DAPK1影响棉铃虫体重,且这种调节作用可能与免疫系统被激活相关。(4)为了研究let-7对棉铃虫生长发育的影响,在未被中红侧沟茧蜂寄生和被寄生之后的棉铃虫体内上调或下调表达let-7。结果表明,过表达或者缺失let-7都使得未被寄生棉铃虫化蛹率降低,且使得被寄生之后棉铃虫体内中红侧沟茧蜂幼虫无法正常结茧,并且寄生之后的棉铃虫体内let-7表达水平显著下调。荧光定量连同双荧光素酶报告实验结果表明,棉铃虫体内let-7的靶基因是Broad isoform Z7(BRZ7)。上调或者下调表达let-7后,检测棉铃虫蜕皮激素和保幼激素通路上的关键基因 earlier response gene(E74),ultraspiracle protein(USP)以及 intracellular receptor methoprene-tolerant(Met)表达情况,结果表明,USP和Met在未被寄生棉铃虫体内可以受到let-7的直接调节,而E74在寄生棉铃虫体内可以受到let-7的直接调节。最终推测,let-7可以通过BRZ7来参与调节棉铃虫蜕皮激素和保幼激素通路相关基因表达变化。(5)棉铃虫被寄生后体内另一差异基因miR-1175,在被寄生后显著上调表达,荧光定量和双荧光素酶报告验证表明,棉铃虫体内miR-1175所对应的靶基因为Insulin-like growth factor receptor type1(IGF1R)。miR-117 的上调或下调表达不会对未被寄生或寄生棉铃虫体内寄生蜂幼虫发育造成影响,但是miR-1175可以连同其靶基因IGF1R来参与调解棉铃虫胰岛素信号通路上关键基因胰岛素受体(Insulin receptor,InR)、蛋白激酶B(ProteinKinase B,Atk/PKB)和转录因子叉头状转录因子O家族(forkhead box O transcription factor,FOXO)的表达变化。