研究背景骨癌痛是一种典型的癌痛,其主要临床表现为：持续的进行性背景痛(Ongoing pain),爆发痛(Breakthrough pain)、痛觉超敏(Allodynia)以及痛觉过敏(Hyperalgesia)。目前临床上针对骨癌痛的治疗以药物治疗为主,包括阿片类药物和NSAID类、类固醇类等辅助药物治疗,但是仍有大约45%的患者的疼痛不能得到有效缓解,其原因一方面是长期使用阿片类药物可引起细胞表面阿片受体减少,需要更大剂量的外源性阿片类药物激动,产生药物耐受现象以及恶心,呼吸抑制等不良反应,另一方面是由于骨癌痛的机制不同于神经病理性痛和炎性痛,它是神经病理变化、炎性反应和组织坏死等因素的综合结果,其发生机制比较复杂,单独用一种镇痛药物治疗常达不到理想效果。骨癌痛发生机制包括外周和中枢机制,在外周,肿瘤生长压迫骨组织和骨膜,肿瘤细胞和局部炎性细胞可释放致痛性细胞因子,肿瘤组织高代谢状态引起的局部缺氧和酸性化等微环境的改变,这些因素都可激活外周伤害性感受器,产生疼痛信号。在脊髓和脊髓上中枢,胶质细胞活化、脊髓内源性阿片系统功能受抑制、广动力范围神经元的活化、神经元突触重塑和兴奋性神经电活动的增加以及细胞因子的表达上调等,这些因素都可导致骨癌模型的中枢敏化,从而形成骨癌痛。近几年的研究发现,趋化因子(如CX3CL1、CCL2、CCL5等)的表达上调也是骨癌痛发生的必要因素,研究发现,采用CX3CR1中和抗体阻断CX3CR1受体功能,可缓解骨癌模型大鼠的痛觉过敏状态；采用CCL2或CCR2的中和抗体均可预防大鼠骨癌痛的发生；肿瘤周围和脊髓CCL5的上调表达也是大鼠骨癌痛的诱导因素。本课题组前期实验中,基因芯片检测骨癌痛大鼠脊髓内的差异表达基因,发现趋化因子CXCL10及其受体CXCR3的表达水平在骨癌痛模型建模后7、14和21天表达均明显升高。由此我们推测,CXCL10的表达上调可能在骨癌痛的发生过程中扮演着重要角色。基于此,本研究将探讨CXCL10在大鼠骨癌痛的发生中的作用及其机制,并进一步研究CXCL10对癌痛治疗的常见药物——吗啡的镇痛作用的影响,以期寻找癌痛治疗的新靶点和新的治疗策略。研究方法和结果1.脊髓CXCL10/CXCR3通路在大鼠骨癌痛的发生中的作用方法：实验一、建立大鼠骨癌痛模型,分别采用real-time PCR和免疫荧光染色检测7、14和21天等时间点脊髓CXCL10和CXCR3的表达变化；实验二、给正常大鼠鞘内注射20ng CXCL10重组蛋白外源性上调脊髓内CXCL10的表达水平,观察其对大鼠机械痛阈的影响；实验三、自骨癌痛模型建立后第一天开始,分别给大鼠鞘内注射100ngCXCL10中和抗体和20μg CXCR3受体拮抗剂-AMG487以阻断CXCL10或CXCR3的功能,分别在1、3、5、7、10和14天测痛,观察对大鼠骨癌痛发生的影响。结果：在大鼠骨癌痛模型建立后7、14和21天脊髓CXCL10和CXCR3mRNA和蛋白的表达均明显升高,且在第14天表达上调最为明显,免疫组化结果显示,骨癌痛大鼠的对侧和术侧脊髓背角中CXCL10和CXCR3的表达均明显增加。给正常大鼠分别鞘内注射20ngCXCL10重组蛋白或10μL生理盐水(saline)后,与naive组和saline组相比,在给药后5mmin开始,CXCL10重组蛋白组大鼠的机械触觉痛阈明显下降(P<0.05),痛阈下降可持续到2h,说明CXCL10具有致痛作用。白骨癌痛模型建模后第1天至第14天,每日给大鼠分别鞘内注射CXCL10中和抗体和CXCR3受体拮抗剂AMG487,均可有效预防骨癌痛大鼠的痛阈下降(P<0.05),说明CXCL10/CXCR3通路的活化参与骨癌痛的发生过程。2.小胶质细胞活化在CXCL10介导的大鼠骨癌痛发生中的作用方法：实验一、采用免疫荧光双标方法检测CXCR3和神经细胞标记物-NeuN(神经元标记物)、GFAP(星形胶质细胞标记物)或CD11b(小胶质细胞标记物)的共表达情况；实验二、建立大鼠骨癌痛模型,自建模后第1天开始,多次鞘内注射CXCR3受体拮抗剂-AMG487(20μg),在第14天取材,采用免疫组化方法观察脊髓小胶质细胞活化的状态；实验三、建立大鼠骨癌痛模型,分别在建模后1-7天或10-14天鞘内注射小胶质细胞抑制剂-米诺环素50μg(1次/),在第7天或14天米诺环素给药后30min给大鼠鞘内注射CXCL10重组蛋白20ng,测痛观察各组大鼠机械痛阈的变化。结果：免疫荧光双标方法检测结果显示,CXCR3可与神经元标记物NeuN大量共表达,广泛分布于大鼠脊髓灰质；CXCR3还可部分地与小胶质细胞标记物CDllb共表达,共表达细胞主要分布在脊髓Ⅳ-Ⅷ板层,说明CXCR3在脊髓主要表达在神经元上,还有一部分表达在小胶质细胞上。CIBP-vehicle组大鼠的脊髓小胶质细胞活化明显,表现为细胞分支变粗,细胞胞体变大,而采用AMG487阻断大鼠脊髓CXCR3的功能后,骨癌痛大鼠的小胶质细胞活化被抑制,说明阻断CXCR3功能可抑制骨癌痛大鼠的脊髓小胶质细胞活化。米诺环素可缓解骨癌痛大鼠早期和中晚期的痛觉敏化(P<0.05),米诺环素预处理对骨癌痛早期CXCL10重组蛋白诱导的痛阈下降没有明显的缓解作用,但可在骨癌痛进程的中晚期阻断CXCL10重组蛋白诱导的痛阈下降(P<0.05),提示在骨癌痛中晚期小胶质细胞活化参与了CXCL10诱导的痛觉敏化。3. CXCL10对吗啡镇痛作用的影响方法：实验一、建立大鼠骨癌痛模型,在第14天先鞘内注射saline10μL或CXCL10中和抗体100ng,30min后鞘内注射吗啡10μg,采用Von Frey丝给各组大鼠测机械痛阈变化；实验二、给正常小鼠鞘内注射生理盐水10μL或小鼠CXCL10重组蛋白(rmCXCL10)30ng后,随后立即皮下注射吗啡10mg/kg,分别在给药前,给药后15、30、60、90和120min等时间点测机械痛阈。结果：鞘内注射CXCL10中和抗体和吗啡都可以缓解骨癌痛的痛觉过敏状态(P<0.01),而预先给予CXCL10中和抗体阻断CXCL10功能后,鞘内注射吗啡的镇痛作用明显增强(P<0.01)。saline-吗啡组小鼠的PWTs在15min后开始升高,在60min时上升到最高水平(14.17±2.04g),CXCL10重组蛋白干预的小鼠给予吗啡后,在60min时PWTs仅达到7.00±2.76g(P<0.01),说明吗啡的镇痛作用可被鞘内注射CXCL10重组蛋白减弱。4.统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示；两组数据之间比较采用t检验,多时间点多组数据之间比较采用重复测量设计的方差分析(ANOVA repeated measurement),分析后采用LSD法检验统计学意义,P<0.05为差异有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1.骨癌痛大鼠脊髓内趋化因子CXCL10及其受体CXCR3表达上调；脊髓内CXCL10外源性过表达可引起正常大鼠的痛觉敏化,阻断CXCL10/CXCR3功能可预防骨癌痛的发生。2. CXCR3表达于脊髓神经元和小胶质细胞中,阻断CXCR3功能可抑制骨癌痛大鼠脊髓内小胶质细胞的活化；抑制小胶质细胞活化可缓解骨癌痛晚期CXCL10重组蛋白诱导的痛觉过敏状态,并抑制骨癌痛大鼠脊髓内CXCL10的表达上调。3.阻断CXCL10功能可增强吗啡对骨癌痛大鼠的镇痛作用,而鞘内注射CXCL10重组蛋白可减弱吗啡的镇痛作用。二、研究结论1.脊髓内CXCL10/CXCR3的上调表达参与骨癌痛的发生和维持；2. CXCL10参与骨癌痛的发生与脊髓小胶质细胞的活化有关；3. CXCL10的表达上调在癌痛的吗啡镇痛治疗起一个负性调节作用。三、创新之处1.本研究首次发现脊髓内CXCL10/CXCR3通路的活化可参与骨癌痛的发生,并且这一过程小胶质细胞活化有关,这为骨癌痛发生机制提供了新的进展和思路；2.本研究首次发现了脊髓内CXCL10的表达上调对癌痛的吗啡镇痛治疗的负性调节作用。四、展望1.本研究发现脊髓CXCL10的表达上调参与了骨癌痛的发生过程,小胶质细胞活化参与了CXCL10功能的调节,继续深入解析CXCL10在骨癌痛形成过程中中枢神经系统内神经元-胶质细胞的cross-talk环路中的作用,有望进一步揭示骨癌痛的发生机制；2.本研究发现CXCL10对骨癌痛的吗啡治疗起负性调节作用,在未来疼痛治疗中我们可结合骨癌痛复杂的发生机制对疼痛进行综合治疗,为临床上癌痛的治疗提供了新的启示。