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根据最新发布的全球10种最常见癌症的发病率和死亡率分布情况,原发性肝癌是全球第六大最常见癌症,第四大癌症死亡原因,每年新增病例约841000例,782000人死亡,中国的发病率也呈逐年上升趋势。原发性肝癌主要类型是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）。HCC起病隐匿、进展迅速、易发生转移、病死率和恶性程度极高。HCC的发病机制目前尚不清楚,人类基因组序列中的非编码RNA与众多肿瘤的发生、转移有关。深入探索HCC的发病机制从而寻找早期诊断方法及有效治疗措施,寻找早期肝癌分子治疗干预新靶点,对提高早期肝癌患者总体生存率具有重要意义。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,Lnc RNAs）在肿瘤疾病中广泛参与肿瘤的发生和进展,大多数Lnc RNA在HCC中的作用机制尚不清楚。Lnc RNA具有类型多、数量多和作用模式多的特点,可通过转录、转录后、表观遗传调控等机制参与DNA甲基化、组蛋白修饰或染色质重塑,介导基因激活或沉默。Lnc RNA与肝细胞癌的转移、侵袭有关,对肝细胞癌的诊断、治疗及预后均有非常重要的意义。目前,通过高通量测序发现Linc02154在HCC组织中高表达,但其在HCC细胞中是否具有生物学功能仍有待研究。故本研究将从体内外的功能及其作用探讨Linc02154在肝细胞癌的发展、转移、侵袭等生物学行为中的作用及其作用机制,试图寻找有效的肝细胞癌基因治疗靶点和丰富肝细胞癌发生发展的机制,为临床的诊断、治疗及预后提供有力的理论和实验依据。目的:1.探究Linc02154在HCC组织的表达情况及与生存预后的关系,研究Linc02154在HCC细胞系中表达及在细胞中的分布情况。2.利用功能获得与缺失实验,确定Linc02154在HCC体内外的生物学功能。3.阐释Linc02154对HCC细胞生物学功能的影响及其作用的分子机制。方法:1.下载TCGA数据库中肝癌的高通量测序结果进行生物信息学分析,获得差异表达的与生存预后相关的候选Lnc RNA。采用实时荧光定量PCR检测候选Lnc RNA在HCC细胞系MHCC-97H、Hep G2、SMMC7721、Hep3B、Huh7中的表达。收集20例HCC临床患者组织检测Linc02154的表达情况。采用两种编码能力预测软件分析Linc02154的编码潜能证实其非编码能力。通过荧光原位杂交实验和细胞核浆分离实验检测Linc02154在HCC细胞中的定位。2.通过分子克隆构建干扰和过表达Linc02154的质粒,包装慢病毒感染HCC细胞形成稳定干扰和过表达Linc02154的HCC细胞系,q RT-PCR实验验证干扰和过表达效率。采用细胞增殖与毒性检测MTS实验、Ed U实验、克隆形成实验检测Linc02154对HCC细胞增殖能力的影响。采用流式细胞术检测Linc02154对HCC细胞周期和凋亡的影响。采用伤口愈合实验、Transwell小室不铺胶迁移实验、Transwell小室铺胶侵袭实验检测Linc02154对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。构建体内裸鼠皮下成瘤模型,观察Linc02154对体内HCC细胞生长增殖能力的影响,免疫组化检测Ki67蛋白表达水平检测Linc02154对细胞增殖能力的影响。3.将Linc02154高表达的SK-Hep1细胞干扰后稳定细胞系进行RNA-seq转录组测序筛选差异表达的基因,通过q RT-PCR在HCC细胞中确认候选靶基因的表达水平,筛选表达具有显著差异的靶基因SPC24,q RT-PCR和Western blot检测SPC24在干扰和过表达Linc02154的HCC细胞中m RNA及蛋白水平的变化情况。利用TCGA数据库分析SPC24与Linc02154共表达的相关性。构建SPC24启动子全长及截断片段（以500 bp为截断单位）的双荧光素酶报告基因质粒,采用双荧光素酶报告基因实验检测Linc02154对SPC24启动子活性的影响。使用KOBAS和KEGG富集Linc02154对SPC24表达相关的信号通路,检测Linc02154对信号通路调节的影响。根据Linc02154的促迁移侵袭生物学功能检测Linc02154对上皮间质转化进程的影响。结果:1.Linc02154在TCGA数据库中高表达log FC=4.033143521且与生存预后相关P=0.034747372（P＜0.05）,在不同HCC细胞系中较对照组明显升高。Linc02154不具有编码蛋白的能力且保守性较低。q RT-PCR检测Linc02154在20对HCC组织中高表达。荧光原位杂交FISH实验和核浆分离实验检测发现Linc02154定位于HCC细胞的细胞核与胞质。2.过表达Linc02154促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭功能,而干扰Linc02154对HCC细胞的增殖、迁移和侵袭功能有抑制作用,流式细胞术检测细胞周期发现干扰Linc02154使HCC细胞的G1/S停滞,过表达Linc02154促进HCC细胞G1/S的转化。流式细胞术检测细胞凋亡发现干扰和过表达Linc02154对HCC细胞凋亡未见显著影响。在裸鼠皮下成瘤模型中发现过表达Linc02154组较对照组皮下肿瘤体积和重量增大,免疫组化检测过表达Linc02154组Ki67的蛋白表达水平显著上调,而干扰Linc02154组得到相反的实验结果。3.Linc02154高表达的SK-Hep1细胞干扰后进行RNA-seq测序分析查阅文献选取干扰后前11个低表达蛋白。通过q RT-PCR验证发现SPC24是在HCC细胞中干扰Linc02154后下调最显著的基因。在SK-Hep1和MHCC-97H细胞中干扰Linc02154后SPC24的m RNA及蛋白表达水平明显降低,过表达Linc02154后SPC24的m RNA及蛋白表达水平明显升高,两者表达趋势一致。SPC24在TCGA数据库肝细胞癌中高表达,与生存相关p＜0.05,且在不同临床分期中表达具有差异。双荧光素酶实验共转染质粒发现Linc02154可增强SPC24启动子的-500 bp-1000区域启动子的活性。Linc02154与SPC24富集的KEGG通路与细胞周期相关,其中PI3K-Akt信号通路具有明显差异。Western Blot检测SK-Hep1和MHCC-97H细胞中PI3K和Akt蛋白水平变化,结果发现,与对照组相比,过表达Linc02154的SK-Hep1和MHCC-97H中PI3K和Akt磷酸化水平升高,而干扰Linc02154后得到相反结果。Linc02154促进HCC迁移侵袭的机制研究发现在过表达Linc02154显著降低了上皮标志物E‐cadherin的表达,促进了间质细胞标志物N‐cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达。干扰Linc02154得到相反的结果。Linc02154可能促进HCC发生EMT进而促进HCC细胞的迁移侵袭。结论:1.Linc02154是一种HCC细胞质和细胞核均存在的长链非编码RNA,其在HCC组织和细胞中高表达,与HCC患者生存预后相关,临床特征上促进HCC的发生和进展。2.HCC细胞体外实验表明Linc02154促进细胞的增殖、迁移和侵袭,促进HCC细胞G1/S期的转化。3.分子机制研究证实Linc02154可增强SPC24启动子的活性,上调SPC24表达,激活PI3K-Akt信号通路的活性从而促进HCC的增殖和周期变化。此外,PI3K-Akt信号通路的激活促进了间质细胞标志物N‐cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达,降低了上皮细胞标志物E‐cadherin的表达,诱导EMT促进HCC细胞的迁移侵袭。