类胡萝卜素组分和含量的变异是导致柑橘果实色泽多样性的主要原因。红色果皮的柑橘品种因其“喜庆”的艳丽色泽一直深受消费者的喜爱,因此也是柑橘果实外观品质遗传改良的一个重要育种目标。但是柑橘新品种的常规选育过程存在成本高,效率低,周期长等诸多限制,因此阐明柑橘果皮类胡萝卜素多态性及色泽形成的遗传机制,并鉴定出与果皮红色性状紧密连锁的分子标记进行辅助育种显得尤为重要。基于此,本研究结合遗传学、多组学、自然群体关联分析、代谢研究和转基因功能验证等多种方法鉴定了柑橘果皮红色性状形成的主效基因及其关键遗传变异位点,并解析了柑橘红色果皮中C₃₀脱辅基类胡萝卜素种属特异演化的分子进化机制。主要研究结果如下:1.基于SLAF简化基因组测序的红橘×枳高密度遗传图谱的构建利用简化基因组测序SLAF-seq技术对红橘和枳F₁双假测交杂交群体的94个杂交子代和亲本进行深度测序,开发了3,817个高质量的SLAF分子标记,并构建了红橘（Citrus reticulata）x枳（Poncirus trifoliata）杂交群体9个连锁群的双亲整合高密度遗传图谱。该遗传图谱分子标记在染色体上分布较均匀,且基因组覆盖度较完整,总图距1,502.44 cM,平均图距为0.42cM。本研究构建的红橘×枳杂交群体高密度遗传图谱将为后续红橘优良的果实品质性状（如红色果皮性状）和枳的优良砧木性状的QTL定位和遗传育种研究奠定重要的基础。2.果皮红色性状形成的类胡萝卜素代谢基础本研究结合半制备液相分离纯化和质谱鉴定了红色果皮中含量较高的C₃₀脱辅基类胡萝卜素β-柠乌素(m/z 433.3[M+H]⁺,C₃₀H₄₀O₂)和β-citraurinene(m/z 419.3[M+H]⁺,C₃₀H₄₂O)。利用红橘×枳杂交群体和柑橘自然群体进行果皮色差值和类胡萝卜素组分含量的关联分析,发现C₃₀脱辅基类胡萝卜素占总类胡萝卜素的比例与柑橘果皮红色性状正相关系数最高（r>0.9,P-value=2.2E-16）。此外与柑橘果皮红色性状负相关系数最高的为叶黄素和玉米黄质。这些结果说明柑橘果皮是一个由多种类胡萝卜素组分共同影响的复杂性状,而其中C₃₀脱辅基类胡萝卜素对果皮红色性状的影响最大。3.柑橘果皮红色性状的BSA分析,精细定位和候选基因的锁定本研究首先利用红橘（红皮果）和枳（黄皮果）杂交子代混池RNA-seq测序产生的SNP进行BSA分析,将果皮红色性状定位在第8号染色体。再用CAPs标记、SLAF-seq开发的SNP标记和交换单株进行精细定位,将区段缩小到了约1.3Mb的区间（Chr 8:16707807¹8021439）。该区间包含CCD4b基因座。红黄果皮混池RNA-seq分析表明CCD4b在红果皮子代混池中的表达量是黄果皮的30多倍。实时荧光定量结果也证实了红皮杂交子代果皮CCD4b基因表达量都高于黄果皮杂交子代。其中亲本红橘的CCD4b基因启动子序列距离起始密码子1537bp处有一个Harbinger类型158bp MITE转座子的插入,且MITE序列上的SNP1^G和SNP2^G与杂交子代红色果皮性状共分离,表明CCD4b很可能是红橘×枳杂交群体果皮红色性状形成的候选基因。4.果皮类胡萝卜素含量的QTL定位本研究通过构建的红橘×枳高密度遗传图谱,对群体12个类胡萝卜素性状进行代谢物mQTL定位。两年的QTL定位共有19个重叠的mQTL位点。其中8个QTL在第八号连锁群的56.2⁸9.0 CM的区间重叠。这个区间能够解释β-柠乌素,β-citraurinene,玉米黄质,叶黄素,黄体黄质,八氢番茄红素,六氢番茄红素和C₃₀脱辅基类胡萝卜素在杂交群体中的变异。这些性状中C₃₀脱辅基类胡萝卜素与总类胡萝卜素的比例在这个区间具有最高的LOD值（LOD≈36）和表型贡献率（PVE≈91%）。这个区间在克里曼丁基因组中的物理位置为Chr 8:17664105...18572910,与上述红黄果皮性状精细定位的区间Chr 8:16707807¹8021439重叠,且重叠区域包含果皮红色性状的候选基因CCD4b,表明CCD4b位点可能是控制群体中C₃₀脱辅基类胡萝卜素和部分C₄₀类胡萝卜素含量变异,进而导致红/黄果皮性状多态性的关键遗传因素。5.候选基因CCD4b的功能验证本研究利用原核表达证实了柑橘CCD4b能够降解玉米黄质产生红色的C₃₀脱辅基类胡萝卜素β-柠乌素。此外利用多基因代谢工程愈伤证实了超表达CCD4b能够在愈伤中产生果皮特有的C₃₀脱辅基类胡萝卜素β-citraurinene,说明CCD4b是控制C₃₀脱辅基类胡萝卜素生物合成的关键基因。超量表达CCD4b也会导致β-胡萝卜素、叶黄素、紫黄质和玉米黄质含量显著下降。这些结果能够与上述类胡萝卜素mQTL结果相互印证,说明CCD4b不仅是C₃₀脱辅基类胡萝卜素变异的主效基因,同时也是杂交群体中C₄₀类胡萝卜素多态性的关键遗传因子。本研究通过原生质体共转化实验证实了CCD4b和拟南芥FBN1a基因共定位,说明CCD4b可能定位在质体小球中,其降解功能可能也发生在质体小球中。与之相互印证的是,超表达CCD4b的愈伤导致质体小球的数量和总面积显著增加,说明转基因愈伤中类胡萝卜素组分和含量的剧烈变化也引起了细胞亚细胞器的适应性重构。6.CCD4b基因表达的等位多态性的分子机理红橘×枳杂交群体和柑橘自然群体中,CCD4b的表达量在与红色性状高度关联。通过杂交群体表达量的eQTL分析表明,CCD4b基因的一个顺式eQTL位点与杂交子代果皮红色性状共分离。自然群体115份材料关联分析结果也表明CCD4b启动子区域MITE转座子序列中的SNP2^G（CAACTG）的G碱基与红色果皮性状紧密连锁,并与CCD4b的高表达量和C₃₀脱辅基类胡萝卜素的含量高度正相关。高分辨率熔解曲线（HRM）实验和等位基因cDNA的PCR产物测序结果表明CCD4b基因的表达存在等位差异,其中在MITE转座子序列中含有SNP2^G（CAACTG）的等位基因对应的CCD4b表达量高于其它等位基因。此外烟草瞬时表达双荧光素酶和GUS酶活性检测实验也证实SNP2^G（CAACTG）能够增强启动子活性。7.柑橘红色果皮中C₃₀脱辅基类胡萝卜素种属特异演化的分子机理CCD4b启动子序列的进化树分析表明CCD4b启动子区域的MITE插入事件和MITE序列中SNP2^G的形成发生在宽皮橘这个种形成之后,与之相对应的是,只有红色果皮的宽皮橘及其杂交种的CCD4b基因高表达,且积累大量C₃₀的脱辅基类胡萝卜素。柑橘有五个CCD4亚家族成员,其中大部分成员都与具有可以降解类胡萝卜素产生C₂₇脱辅基类胡萝卜素功能的其它植物CCD4基因聚在一起,但是CCD4b却与它们处在不同的进化枝中,暗示CCD4b基因是在柑橘CCD4基因亚家族复制进化的事件中产生了功能分化。此外栽培、野生和原始柑橘的CCD4b关键功能域的氨基酸序列很保守,说明CCD4b基因的功能分化事件可能发生在柑橘形成早期,而宽皮橘形成之后,顺式调控区序列的变异导致了CCD4b表达量在红色果皮的宽皮橘中急剧提高,进而导致了C₃₀脱辅基类胡萝卜素仅在红色果皮的宽皮橘及其杂交种中大量积累的种属特异演化。