【摘 要】
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背景:自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是一种累及肝实质的渐进性坏死性炎症性肝病,其临床表现复杂,发病率及死亡率均较高,发病机制尚未阐明。晚期糖基化终产物受体（RAGE）属于免疫球蛋白（Ig）超家族,在所有类型的白细胞上表达,它能促进不同细胞的活化、迁移和成熟,是炎症反应发生和维持的关键分子。刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠肝炎模型是模拟人自身免疫性肝病的最佳小鼠模
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背景:自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是一种累及肝实质的渐进性坏死性炎症性肝病,其临床表现复杂,发病率及死亡率均较高,发病机制尚未阐明。晚期糖基化终产物受体（RAGE）属于免疫球蛋白（Ig）超家族,在所有类型的白细胞上表达,它能促进不同细胞的活化、迁移和成熟,是炎症反应发生和维持的关键分子。刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠肝炎模型是模拟人自身免疫性肝病的最佳小鼠模型。本实验室在前期的研究中发现高迁移率族蛋白1（HMGB1）加剧ConA诱导的小鼠肝损伤,ConA诱导的肝损伤涉及Toll样受体4（TLR4）,并提示其他受体RAGE、TLR2也可能参与ConA诱导的肝炎。然而RAGE在ConA诱导的肝炎中的作用尚未报道,需要进一步的研究来阐明这个问题。目的:通过建立ConA诱导的肝炎模型,检测在该模型中RAGE表达的变化,探究RAGE基因缺陷对ConA诱导的肝炎发展的影响及其可能机制,并为临床治疗自身免疫性肝炎提供依据。方法:1.ConA诱导的肝炎模型的制备:C57BL/6背景的野生型小鼠（WT）与RAGE基因缺陷小鼠(RAGE-/-,C57BL/6背景)经尾静脉注射ConA（15 mg/kg）,在肝损伤诱导10小时后处死小鼠,收集实验所需要的样本;2.荧光定量PCR、免疫组织化学以及流式细胞术检测WT小鼠在ConA诱导前后肝脏组织中RAGE的m RNA水平和蛋白水平的表达变化以及肝脏和脾脏中T细胞表面RAGE的表达变化;3.记录ConA致死剂量（20 mg/kg）注射后WT小鼠以及RAGE-/-小鼠生存曲线。检测小鼠血清中ALT及AST的水平,肝脏H＆E染色来评估肝脏的病理学改变,免疫组织化学以及髓过氧化物酶（MPO）活性检测肝脏组织中性粒细胞的浸润;4.流式细胞术检测肝脏单个核细胞中NK、NKT以及T细胞的比例,T细胞亚群的比例及活化状态,脾脏T细胞亚群活化状态以及体外检测脾脏T细胞增殖情况;5.流式细胞术检测肝脏单个核细胞中Th细胞的比例。荧光定量PCR检测肝脏组织中细胞因子IL-6、TGF-β、IFN-γ以及TNF-α表达水平,ELISA检测血清中炎症性细胞因子IL-6、IFN-γ以及TNF-α表达水平。流式细胞术检测肝脏单个核细胞T细胞、DC和Kupffer细胞分泌IL-6的情况;6.蛋白免疫印迹法检测肝脏组织中Arid5a水平以及JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的水平。结果:1.小鼠血清ALT及AST水平检测、肝脏大体标本观察以及组织病理学结果显示,ConA诱导的小鼠肝炎模型成功建立;2.小鼠肝脏组织荧光定量PCR及免疫组化检测均显示ConA诱导后野生型实验组小鼠肝脏中RAGE的表达较野生型对照组小鼠明显升高,肝脏及脾脏中CD4+T细胞表面RAGE表达上调;3.致死剂量的ConA诱导后,RAGE-/-小鼠的生存率比WT小鼠显著提高。ConA诱导后,RAGE-/-小鼠血清中ALT和AST水平均低于WT小鼠,肝脏病理显示RAGE-/-小鼠肝脏坏死明显少于WT小鼠。RAGE-/-小鼠肝脏中性粒细胞浸润较WT小鼠减少;4.ConA诱导后RAGE-/-小鼠肝脏单个核细胞中NK细胞的比例较WT小鼠上升而T细胞的比例减少,NKT细胞无明显变化,此外,RAGE-/-小鼠CD4+T细胞的比例低于WT小鼠。体外ConA刺激脾脏淋巴细胞增殖发现,相较于WT小鼠,RAGE-/-小鼠T细胞增殖减少。ConA诱导后,RAGE-/-小鼠和WT小鼠肝脏单个核细胞中CD4+T及CD8+T细胞活化比例无明显差异,而RAGE-/-小鼠脾脏CD4+T细胞活化比例低于WT小鼠,CD8+T细胞则无明显差异;5.ConA诱导后RAGE-/-小鼠肝脏单个核细胞中Th17的比例较WT小鼠显著下降而Th1和Th2细胞比例无统计学差异。ConA诱导后RAGE-/-小鼠肝脏组织中IL-6m RNA水平较WT小鼠显著降低,而TGF-β、TNF-α以及IFN-γ水平无统计学差异。血清中RAGE-/-小鼠IL-6及TNF-α水平明显低于WT小鼠,而IFN-γ水平无统计学差异。ConA诱导后RAGE-/-小鼠肝脏单个核细胞中T细胞、DC及Kupffer细胞分泌的IL-6均明显减少;6.ConA诱导后RAGE-/-小鼠肝脏组织Arid5a蛋白表达明显低于WT小鼠,JAK2及STAT3的磷酸化水平降低。结论:1.RAGE基因缺陷改善ConA诱导的肝损伤;2.RAGE基因缺陷减少ConA诱导的肝炎中肝脏募集的T细胞比例,抑制T细胞活化及增殖,其中主要影响CD4+T细胞;3.RAGE基因缺陷抑制ConA诱导后肝脏中Th17细胞分化,减少T细胞、DC及Kupffer细胞分泌的IL-6;4.RAGE基因缺陷减少ConA诱导后肝脏Arid5a蛋白表达进而减少IL-6的表达。
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