研究背景急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)死亡率高,即使幸存者,,心功能亦有不同程度的损害,严重危害人们健康。它不仅影响病人的生活质量,而且也给患者家庭和社会增加了过重的负担。近20年来,AMI的诊断和治疗取得了长足进步。一方面,溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous Coronary Intervention, PCI)和冠状动脉旁路移植术(Coronary Artery Bypass Grafting, CABG)等血运重建治疗措施极大地改善了这些病人的预后,另一方面,却又引起了不容忽视的心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury, MIRI),从而降低了其临床疗效。MIRI的发生和发展过程是一个多因素相互作用的级联反应,主要的损伤机制有自由基损伤、钙超载、微血管损伤和白细胞的作用等。近年来研究发现,补体、选择素、内皮素和细胞凋亡等均参与了MIRI的病理变化过程和结果。可见,MIRI可能是多分子、多机制、相互影响、相互促进的病理变化。多年来,MIRI一直是心肌缺血治疗中难以解决的问题。虽然尝试了大量的新药和多种防治措施,但由于其作用途径均是外源性的,所以对MIRI治疗始终未获得突破性进展,到目前为止仍无系统性治疗措施。Notch是高度保守的信号转导通路,其调控细胞增殖、分化和凋亡的功能涉及几乎所有组织和器官。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和核效应物三部分组成。在哺乳动物中共发现4类Notch受体(Notch1, Notch2, Notch3和Notch4)和2类配体(Serrate样配体Jagged1、Jagged2和Delta样配体Delta-like1、Delta-like3和Delta-like4)。Notch信号由两个邻近细胞的Notch受体与配体相互作用而激活。受体与配体的结合导致受体构象发生改变,从而暴露受体胞外域的TACE金属蛋白酶切割位点,随后在γ-分泌酶的介导下发生蛋白水解作用,释放出Notch的胞内段(Notch intracellular domain, NICD), NICD转移至细胞核内,与转录抑制因子RBP-J κ(也称为CSL/CBF1)结合,招募共活化物女MAML和组蛋白乙酰基转移酶p300/CBP等后,即成为转录活化因子,调控Hes-1和其他靶基因的表达,最终影响细胞的分化、增殖和凋亡。多项研究已经证实Notch-1具有抑制细胞凋亡的功能。Notch-1可下调线粒体凋亡蛋白Bax的表达,减少连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP,是IAP家族中最强的凋亡抑制因子)的降解,促进NF-κB的转录活性,调控一些凋亡相关蛋白和与增殖有关蛋白的表达,如细胞周期蛋白D(CyclinD1)、P53及Bcl-2,发挥其抗凋亡的作用。Yu等人研究发现,阻断Notch信号通路可通过抑制Hes5-STAT3复合物的形成降低STAT3磷酸化水平,后者导致ROS生成增多,细胞凋亡率增加。已有研究证实,心肌梗死后Notch-1表达上调,激活的Notch-1对心肌细胞具有保护作用,并且该作用是通Notch-1/Hes-1激活PI3K/Akt传导通路,上调磷酸化Akt的表达而实现的,为Notch-1的心脏保护作用提供了有力的证据。目前,尚无研究关注Notch-1在心肌缺血再灌注中的作用和机制。因此,以Notch-1为目标的干预性研究可能为MIRI防治开辟新的途径。目的1.建立大鼠心肌梗死和心肌缺血再灌注模型,检钡Notch信号家族表达变化情况；2.分离培养SD乳鼠心肌细胞,建立心肌细胞缺氧/复氧模型以模拟心肌缺血再灌注损伤,从细胞水平探讨Notch-1对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响；重组腺相关病毒载体转染心肌细胞后建立心肌细胞缺氧/复氧模型,探Notch-1心肌缺血再灌注损伤的保护作用的机制,为缺血再灌注损伤的防治提供新的途径。对象和方法第一部分体内实验54只健康雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组(Sham组),心肌梗死组(MI组)和心肌缺血再灌注组(MIRI组)。MIRI组采用结扎左冠状动脉前降支30min,再灌注120min的方法建立心肌缺血再灌注模型,再灌注120min后,颈静脉注射Evans Blue染料；取左心室缺血部位心肌标本,TTC法测定左心室心肌梗死面积；TUNEL染色检测凋亡水平。QRT-PCR、Western Blotting法检测心肌组Notch信号家族表达水平。每组18只SD大鼠中,9只处死后取心脏提取总RNA用于PCR,9只提取心脏组织蛋白用于Western Blotting。第二部分体外实验采用胰酶/胶原酶消化法分离和培养乳鼠原代心肌细胞,分为对照组,重组大鼠可溶性Jagged-1嵌合蛋白(sJag-1)预处理组和DAPT预处理组,每组设3个复孔,实验重复3次。后两组在预处理48h分别上调和抑制心肌细Notch-1ICD的表达后,进行心肌细胞缺氧/复氧模型模拟心肌缺血再灌注,观察心肌细胞搏动和形态学变化,Western blotting法检测心肌细Notch-1ICD和Hes-1表达,Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测心肌细胞坏死和凋亡水平。采用三质粒共转染法和HEK293细胞进行8型重组腺相关病毒(rAAV-8)的包装、浓缩,最终获得高效、稳定表达Notch-1ICD基因的腺相关病毒pAAV-N1ICD-6×myc。利用带有EGPF报告基因的rAAV-8确定转染时合适的病毒滴度和感染效率。建立心肌细SNotch-1ICD过表达模型,Western Blotting法检Notch-1ICD和Hes-1的表达,接着进行心肌细胞缺氧/复氧模拟心肌缺血再灌注,观察心肌细胞搏动和形态学变化,Westem blotting法检测心肌细胞Bcl-2、Akt、磷酸化Akt、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达。结果1.动物实验结果1.1正常心脏组织中可检测至D11-4、Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4mRNA的表达。在MI和MIRI时,Notc信号家族的RNA表达水平发生了明显的变化：(1)假手术组、MI组和MIRI组D11-4mRNA2-△△ct值分别为1.03±0.20、0.62±0.17和0.32±0.20,差异具有统计学意义(F=31.34,P<0.001)。MI时心肌细胞D11-4的含量是正常对照组的0.6倍(P<0.001),MIRI时D11-4mRNA含量进一步下降,分别是正常对照组的0.31(P<0.001)倍和MI组的0.52倍(P=0.003)。(2)假手术组、MI组和MIRI组Jagged-1mRNA2-△△ct值的平均秩次14、23和5,差异具有统计学意义(x2=23.143,P<0.001)。MI时心肌细胞Jagged-1mRNA的含量上升至正常对照组的1.2倍(P=0.002),MIRI时Jagged-1mRNA含量分别减少至正常对照组的0.42倍(P<0.001)和MI组的0.35倍(P<0.001)。(3)假手术组、MI组和MIRI组Notch-1mRNA2-△△ct值的平均秩次14、23和5,差异具有统计学意义(χ2=23.143,P<0.001)。MI时心肌细Notch-1mRNA的含量上升至正常对照组的2.42倍(P<0.001),MIRI时Notch-1mRNA含量分别下降至正常对照组的0.31倍(P<0.001)和MI组的0.13倍(P<0.001)。(4)假手术组、MI组和MIRI组Notch-2mRNA2-△△ct值分别为1.01±0.02、0.71±0.02和0.62±0.02,差异具有统计学意义(F=1012.14,P<0.001)。MI时心肌细胞Notch-2mRNA的含量是正常对照组的0.71倍(P<0.001), MIRI(?)Notch-2mRNA含量进一步下降,分别是正常对照组的0.62倍(P<0.001)和MI组的0.71倍(P<0.001)。(5)假手术组、MI组和MIRI组Notch-3mRNA2-△△ct值分别为0.99±0.04、0.92±0.02和0.56±0.02,差异具有统计学意义(F=603.52,P<0.001)。MI时心肌细胞Notch-3mRNA的含量是正常对照组的0.93倍(P<0.001), MIRI时Notch-3mRNA含量进一步下降,分别是正常对照组的0.57倍(P<0.001)和MI组的0.61倍(P<0.001).。(6)假手术组、MI组和MIRI组Notch-4mRNA2-△△ct值分别为1.02±0.10、0.80±0.10和0.52±0.12,差异具有统计学意义(F=52.352,P<0.001)。MI时心肌细Notch-4mRNA的含量是正常对照组的0.78倍(P<0.001), MIRI(?)Notch-4mRNA含量进一步下降,分别是正常对照组的0.51倍(P<0.001)和MI组的0.65倍(P<0.001)。1.2正常心脏组织中可检测至Notch-1信号的活性形式Notch-1ICD和下游信号分子Hes-1的蛋白表达。在MI和MIRI时,Notch信号家族的蛋白表达水平发生了明显的变化：假手术组、MI组和MIRI组ROD分别为1.20±0.09、1.62±0.07和0.14±0.08,各组间Notch-1ICD ROD值方差齐(F=0.060,P=0.942),各组间差异均具有统计学意义(F=853.39,P<0.001)。与对照组相比,MI组心肌细胞Notch-1ICD的蛋白量增加了1.35倍(P<0.001),MIRI组心肌细Notch-1ICD的蛋白量则显著下降,分别是对照组的0.12倍(P<0.001)和MI组的0.09倍(P<0.001)。假手术组、MI组和MIRI组ROD分别为1.72±0.19、3.90±0.22和0.49±0.17,各组间Hes-1ROD值方差齐(F=0.774,P=0.472),各组间差异均具有统计学意义(F=722.997,P<0.001)。正常心肌组织中也可以检测到Hes-1的表达。与对照组相比,MI组心肌细胞Hes-1的蛋白量增加了2.27倍(P<0.001), MIRI组心肌细胞Hes-1的蛋白量则显著下降,分别是对照组的0.28倍(P<0.001)和MI组的0.13倍(P<0.001)。2.细胞实验结果2.1用胰酶／胶原酶消化法成功分离心肌细胞细胞,建立细胞缺氧和缺氧／复氧模型,Annexin V/PI染色结果表明,阳性对照组细胞死亡率为0.945±0.015,阴性对照组细胞凋亡率为0.045±0.010。缺氧组细胞凋亡率为0.432±0.026,缺氧／复氧组细胞凋亡率为0.742±0.021。缺氧时心肌细胞凋亡率较正常组显著增加(P<0.001),恢复氧气供应后,细胞凋亡率不降反升(P<0.001),证明心肌细胞缺氧模型和缺氧/复氧模型有效,各组间差异具有统计学意义(F=2472.068,P<0.001)。2.2对照组、sJag-1处理组和DAPT处理组Notch-1ICD ROD分别为0.38±0.08、0.45±0.07和0.08±0.04,组间方差齐(F=2.241,P=0.128),采用One-Way ANOVA进行统计分析,各组间差异均具有统计学意义(F=89.991,P<0.001)。与对照组相比,sJag-1处理组心肌细胞Notch-1ICD的蛋白量是对照组的1.18倍(P=0.165), DAPT组心肌细胞Notch-1ICD的蛋白表达量是对照组的0.21倍(P<0.001)。对照组、sJag-1处理组和DAPT处理组Hes-1ROD分别为1.72±0.19、3.90±0.22和0.49±0.17,组间方差齐(F=1.071,P=0.358),采用One-Way ANOVA进行统计分析,各组间差异均具有统计学意义(F=328.407,P<0.001)。与对照组相比,sJag-1处理组心肌细胞Hes-1的蛋白表达量是对照组的2.27倍(P=0.004),DAPT处理组心肌细胞Hes-1的蛋白量则显著下降,是对照组的0.28倍(P<0.001)。2.3缺氧/复氧组细胞凋亡率为0.585±0.097, sJag-1预处理组细胞凋亡率显著下降(0.490±0.047,P=0.041),DAPT预处理组凋亡率显著升高(0.778±0.064,P<0.001),各组间差异具有统计学意义(F=23.958,P<0.001)。2.4转染rAAV-GFP的心肌细胞胞浆可见绿色荧光蛋白GFP表达,在荧光显微镜下可计数GFP阳性的心肌细胞。随着病毒感染复数的增加,表达GFP的心肌细胞数量增加,GFP阳性细胞百分率升高,因此GFP阳性细胞百分率可代表腺相关病毒介导的基因转导效率。当MOI为200时,转染后48小时约92%的心肌细胞出现绿色荧光,当MOI为300时,其百分率有增加,但增加不显著。因此,MOI200被视为最佳感染复数。2.5对照组、rAAV-EGPF组和pAAV-N1ICD组Notch-1ICD ROD分别为0.10±0.01、0.12±0.03和0.51±0.02,组间方差齐(F=1.737,P=0.197),采用One-Way ANOVA进行统计分析,各组间差异均具有统计学意义(F=1368.472,P<0.001)。与对照组相比,rAAV-EGPF组Noteh-1ICD蛋白表达量没有变化(P=0.700),pAAv-N1ICD转染后心肌细胞Notch-1ICD的蛋白表达显著增加,是对照组的5倍(P<0.001)。2.6对照组.rAAV-EGPF组和pAAV-N1ICD组Bcl-2ROD分别为0.09±0.02.0.07±0.02和0.38±0.04,组间方差齐(F=2.711,P=0.087),采用One-Way ANOVA进行统计分析,差异均具有统计学意义(F=354.744,P<0.001)。与对照组相比,H/R组Bcl-2蛋白表达量略有下降,差异不具有统计学意义(P=0.135).H/R+pAAV-N1ICD组Bcl-2的蛋白表达量是对照组的4.22倍(P<0.001)。对照组、rAAV-EGPF组和pAAV-N1ICD组ppAkt/Akt ROD分别为0.12±0.04、0.03±0.01和0.07±0.02,组间方差齐(F=2.947,P=0.072),采用One-Way ANOVA进行统计分析,各组间差异均具有统计学意义(F=28.534,P<0.001)。与对照组相比,H/R组和H/R+pAAV转染组心肌细胞总Akt蛋白表达量没有显著变化,H/R组心肌细胞磷酸化Akt的蛋白表达量是对照组的0.25倍(P<0.001),pAAV转染后磷酸化Akt的蛋白表达量升高,分别是对照组和H/R组的0.58倍和2.33倍。对照组、rAAV-EGPF组和pAAV-N1ICD组p-ERK1/ERkl ROD(F=16.773,P<0.001)和p-ERk2/ERk2ROD(F=15.397, P<0.001)组间方差不齐,采用Kruskal-Wallis Test进行非参数检验,对照组、rAAV-EGPF组和pAAV-N1ICD组p-ERK1/ERk1ROD平均秩次分别为23、5.44和13.56,组间差异具有统计学意义(x2=22.056,P<0.001).p-ERk2/ERk2ROD平均秩次分别为21.22、5和15.78,组间差异具有统计学意义(χ2=19.474, P<0.001)。采用Tamhane法进行组间多重比较,与对照组相比,H/R组和H/R+pAAV转染组心肌细胞总ERK1/2蛋白表达量没有显著变化,H/R组心肌细胞磷酸化ERK1的蛋白表达量是对照组的0.12倍(P<0.001),磷酸化ERK2的蛋白表达量是对照组的0.06倍,pAAV转染后磷酸化ERK1/2的蛋白表达量升高,其中ERK1分别是对照组和H/R组的0.32倍和2.67倍,ERK2分别是对照组和H/R组的0.58倍和9倍。结论1.本实验建立了在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,通过QRT-PCR和Western Blotting法证实Jagged-1及其受Notch-1在心肌梗死时表达上调,心肌缺血再灌注时下调,后者可能与缺血再灌注损伤有关。2.本实验成功建立了体外乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型,sJag-1激活心肌细胞Notch-1ICD对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤有显著的保护作用；3.成功构建了重组腺相关病毒载体rAAV-N1ICD,通过rAAV介导Notch-1ICD在心肌细胞中高表达,证实Notch-1的心肌保护作用与上调Bcl-2的表达,激活Akt和ERK1/2途径有关。