论文部分内容阅读
屈昔多巴(L-threo-DOPS)是近30年来唯一获批的用于治疗帕金森症引起的体位性低血压的药物。目前,屈昔多巴的工业化生产一直依赖于光学拆分,光学拆分将导致至少一半的原料成为工业废料,不符合原子经济原则。以甘氨酸和3,4-二羟基苯甲醛为底物,L-苏氨酸醛缩酶(L-TA)可以催化屈昔多巴的立体选择性合成,反应简捷高效。然而,Cβ立体选择性一直是L-TA应用的瓶颈问题,这一问题在屈昔多巴的催化合成中尤为突出:之前报道的催化合成屈昔多巴的最优酶,其产物de值仅为55.4%。在实验室前期工作基础上,本论文通过计算机虚拟突变和实验验证,发现128位氨基酸对酶和底物的结合有重要影响。进一步对128位氨基酸进行了饱和突变,发现了高立体选择性突变体H128N,并将其应用到屈昔多巴的酶法和整细胞催化合成。之后,通过计算机建模和对接技术,推测了128位氨基酸影响L-TA的立体选择性和酶活的作用机制。本文主要研究内容和结论如下:(1)通过计算机虚拟突变和实验验证,发现128位氨基酸对酶催化性能的重要性。1)利用计算机虚拟突变技术,对L-TA的酶活位点进行虚拟饱和突变,发现His128的突变改造可以增强酶和底物的结合能力。2)基于前期工作中的突变体GB-L,针对L-TA的酶活位点和关键残基,进行了初步的突变改造和性能筛选,发现了突变体H128I,其催化合成屈昔多巴的de值为93.5%,这是已知的立体选择性最高的屈昔多巴合成酶。虽然H128I具有高立体选择性,然而其催化合成屈昔多巴的产率却降低较多,因此有必要对His128进行饱和突变,以发现性能更优的突变体。(2)His128饱和突变及突变体H128N的发现。1)对GB-L的His128进行饱和突变,发现:H128N催化合成屈昔多巴的de值为92.9%,产率达到了1.3 mg/m L,与GB-L相比,H128N的产率和立体选择性都得到了提高,因此我们选择H128N进行后续研究。2)通过对获得的突变体的催化性能进行分析,发现:His128位突变为体积较大的氨基酸(例如H128W、H128R)或侧链有活泼氢的氨基酸(例如H128T、H128S、H128C、H128E),立体选择性和产率都明显降低;突变为疏水性氨基酸(例如H128I、H128A、H128V)可以提高或略微降低非对映选择性,这一结果证明His128作为碱参与催化的作用,可以被其它残基有效替代,不会对酶的立体选择性产生影响。这些分析结果也为之后H128N的催化机制研究提供了可靠数据。(3)H128N催化合成屈昔多巴的条件优化和酶促动力学研究。1)经过条件优化,H128N的最优催化条件为:在p H=6.5的PBS缓冲液中,加入1 M甘氨酸,60 m M 3,4-二羟基苯甲醛,1 mg L-TA H128N,50μM PLP(磷酸吡哆醛),37 oC反应4 h。2)H128N的酶促动力学参数测定发现:对于底物L-苏氨酸,H128N具有较低的Km,较高的kcat和kcat/Km;这些动力学参数显示了H128N高立体选择性的内在原因。(4)通过计算机建模和对接技术解释H128N催化合成屈昔多巴的机制。针对模板蛋白GB-L、高立体选择性突变体H128N和立体选择性翻转的H128R,将反应中间体与其对接,发现:1)反应原料3,4-二羟基苯甲醛从不同方向靠近反应中间体PLP/glycine(辅酶PLP和甘氨酸的亚胺复合物),从而生成L-threo-DOPS及其立体异构体L-erythro-DOP;2)在H128N中,组氨酸取代天冬酰胺后,降低了底物进入时可能的静电斥力,有利于L-threo-DOPS的生成;3)大体积的128位氨基酸会阻碍原料从利于L-threo-DOPS生成的方向进攻,从而使立体选择性极大降低,例如H128R的立体选择性翻转,主要催化生成屈昔多巴的立体异构体。(5)利用表达最优突变体H128N的整细胞催化合成屈昔多巴。1)整细胞催化合成屈昔多巴的最佳反应条件为:在Tris-HCl(p H=7.0)中,加入2 M甘氨酸,140 m M 3,4-二羟基苯甲醛,50μM PLP,400 mg/m L整细胞,37℃反应1 h。2)在最优反应条件下,屈昔多巴de值为95.4%,产率为1.6 mg/m L;当反应时间为7h时,产率达到了4.7 mg/m L,但de值随之降低。相比于之前文献中报道的最优酶(55.4%de),本论文中所获得的突变体表现了更优秀的催化性能。进一步的工艺优化将有助于在保持高立体选择性的同时,进一步提高屈昔多巴的合成产率。本论文的工作不仅为屈昔多巴的酶法合成提供了难得的高立体选择性生物催化剂,其相关理论研究也为其它L-TA酶的改造提供了重要参考。