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矽肺病(Silicosis)是尘肺病的一种主要类型,是由于吸入含游离二氧化硅的粉尘引起的以肺纤维化为主的不可逆进行性疾病。矽肺病病理过程复杂,游离二氧化硅粉尘激活肺巨噬细胞,损伤肺泡上皮细胞,促进上皮间质转化、成纤维细胞激活与增殖等。这一过程包含了氧化应激、免疫应答、炎症反应及纤维化形成多个阶段,最终导致细胞外基质(ECM)大量沉积及肺泡结构破坏。近些年有关矽肺发病的分子机制及干预研究取得了一些进展,但目前仍没有找到有效的药物治疗方法。上皮-间质转化(EMT)是一种动态的、可逆的过程。在EMT期间,上皮细胞失去极性和细胞间连接,上皮细胞标志物表达降低并产生间充质标志物,使其从上皮表型向间充质表型转换,从而获得迁移特性。研究表明,EMT参与纤维化和癌转移等各种病理过程。有文献报道EMT在矽尘诱导的肺纤维化中起着重要的作用,本课题组研究也证实了这一点,但确切的分子机制尚需进一步探索。长链非编码RNA(LncRNA)是一类功能性RNA,它们通过包括表观遗传、转录和转录后调控在内的基因网络来调节多种生物过程。研究发现lncRNA在包括组织纤维化在内的多种病理中表达失调,表明它可能在疾病进展中发挥重要作用。据报道,lncRNA可以通过吸附结合相应的miRNA促进EMT进而调控组织纤维化。LncRNA-ATB是一种TGF-β激活的lncRNA,在TGF-β信号通路中具有重要作用。目前研究发现lncRNA-ATB参与多种肿瘤疾病的进展,它通过调节TGF-β诱导的EMT来控制肿瘤细胞的转移和侵袭,然而有关lncRNA-ATB在矽肺中的功能与机制的研究甚少。本课题组先前的研究通过敲低lncRNA-ATB的表达进行miRNA芯片筛选,证实lncRNA-ATB可通过竞争性吸附miR-200c调控EMT进程,从而影响矽尘诱导的肺纤维化进展。我们特别感兴趣的是,在miRNA芯片数据中,除了miR-200c表达具有显著差异外,其他一些miRNAs的表达也明显失调。在本研究中,我们将miR-29b-2-5p和miR-34c-3p确定为lncRNA-ATB的两个新靶标。与miRNA芯片结果一致,在TGF-β1诱导肺泡上皮细胞EMT模型中,利用si RNA敲低lncRNA-ATB的表达后,miR-29b-2-5p和miR-34c-3p的水平显著升高。因此,本课题将进一步研究在矽尘所致肺纤维化中,lncRNA-ATB是否通过调控miR-29b-2-5p和miR-34c-3p影响EMT过程进而发挥促纤维化作用,并揭示其作用的具体分子机制,从而为矽肺病的防治提供理论依据与潜在的治疗靶标。目的根据前期实验结果,体外实验干预lncRNA-ATB表达探索miR-29b-2-5p和miR-34c-3p是否为lncRNA-ATB的两个新靶miRNAs,同时探索lncRNA-ATB与miR-29b-2-5p和miR-34c-3p在EMT中的调控关系以及具体的分子机制;整体动物水平单独或者同时高表达miR-29b-2-5p和miR-34c-3p,研究其对肺纤维化进程的影响,为治疗矽肺病寻找新的治疗策略。方法1.使用lncRNA-ATB的si RNA或者过表达质粒处理上皮细胞,检测miR-29b-2-5p、miR-34c-3p的表达水平;双荧光素酶报告基因实验、RIP以及RNA pull down实验验证lncRNA-ATB与miR-29b-2-5p、miR-34c-3p的结合。2.TGF-β1处理A549和Beas-2B细胞,构建肺上皮细胞EMT模型,q RT-PCR检测miR-34c-3p、miR-29b-2-5p表达情况,Western Blot检测纤维化和EMT标志物的表达;细胞内转染miR-34c-3p或miR-29b-2-5p mimic,q RT-PCR、Western Blot检测EMT相关分子的表达水平。3.Western blot观察lncRNA-ATB si RNA和miR-29b-2-5p、miR-34c-3p inhibitor干预对EMT及纤维化标志物表达的影响,进一步证实其调控关系。4.生物信息学网站预测miR-34c-3p和miR-29b-2-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的结合。TGF-β1诱导的细胞EMT模型中以及过表达miR-34c-3p和miR-29b-2-5p后,Western Blot检测靶基因的表达。5.气管内滴注二氧化硅悬浊液构建小鼠肺纤维化模型;在此基础上,分别通过尾静脉注射miR-34c-3p与miR-29b-2-5p agomir构建两种miRNA的agomir干预模型;气管内单独或者联合滴注miR-34c-3p与miR-29b-2-5p过表达腺病毒,三周后再经气管滴注二氧化硅悬浊液,构建两种miRNA的单独或联合的干预模型。病理切片HE染色评估纤维化病变程度;Western Blot以及羟脯氨酸含量测定检测纤维化和EMT标志物表达,观察对EMT的联合抑制作用;同时q RT-PCR检测miR-34c-3p与miR-29b-2-5p表达情况。结果1.LncRNA-ATB结合吸附miR-34c-3p与miR-29b-2-5p本课题组前期通过芯片筛检发现miR-34c-3p、miR-29b-2-5p可能是lncRNA-ATB的两个靶miRNAs。本研究中,在A549细胞中用si RNA或过表达质粒分别敲低或升高lncRNA-ATB的表达后,miR-29b-2-5p和miR-34c-3p的表达水平相应地升高或降低。而后生物信息学网站预测并用双荧光素酶报告基因实验、RIP以及RNA pull-down实验证明了lncRNA-ATB与miR-34c-3p和miR-29b-2-5p间均存在直接结合。2.LncRNA-ATB调控miR-34c-3p和miR-29b-2-5p促进肺上皮细胞EMT进程TGF-β1处理A549、Beas-2B细胞构建EMT模型,发现EMT模型中LncRNA-ATB表达上升,而miR-34c-3p和miR-29b-2-5p表达下降。分别使用miR-34c-3p和miR-29b-2-5p mimic处理细胞升高miRNA的表达,发现miR-34c-3p和miR-29b-2-5p mimic均能升高E-cadherin水平,降低Vimentin、Fibronectin和α-SMA水平,表明过表达miR-34c-3p和miR-29b-2-5p可以抑制肺上皮细胞EMT进程。而后,在细胞内共转染lncRNA-ATB si RNA和miR-34c-3p或miR-29b-2-5p inhibitor进行回复实验,结果显示低表达lncRNA-ATB可以抑制肺上皮细胞的EMT进展,而在此基础上同时敲低miR-34c-3p或miR-29b-2-5p的表达可以阻遏lncRNA-ATB si RNA的EMT抑制作用,提示lncRNA-ATB可结合吸附miR-34c-3p、miR-29b-2-5p调节肺上皮细胞的EMT。3.MEKK2、Notch2是miR-29b-2-5p和miR-34c-3p的下游功能性靶基因为进一步验证miR-29b-2-5p和miR-34c-3p的下游功能性靶基因,通过生物信息学软件预测miR-34c-3p和miR-29b-2-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证了miR-34c-3p与MEKK2、Notch2以及miR-29b-2-5p与MEKK2的结合。在TGF-β1诱导的细胞EMT模型中,检测发现TGF-β1处理A549、Beas-2B细胞后,MEKK2和Notch2表达升高,而细胞内转染miR-34c-3p或miR-29b-2-5p mimic后则可以抑制MEKK2和Notch2表达的升高,表明miR-34c-3p和miR-29b-2-5p通过靶向MEKK2、Notch2调控EMT。4.二氧化硅诱导的小鼠肺纤维化中miR-34c-3p和miR-29b-2-5p低表达小鼠矽肺模型组织切片染色显示,随着染尘时间的增加,小鼠肺组织出现弥漫性纤维化,肺纤维化程度增加,羟脯氨酸含量逐渐增加;Western blot观察到,上皮细胞标志物E-cadherin表达降低,而细胞外基质Fibronectin以及间充质细胞标志物α-SMA、Vimentin表达呈时间依赖性升高;同时miR-34c-3p和miR-29b-2-5p水平逐渐下降。5.过表达miR-34c-3p和miR-29b-2-5p能减轻二氧化硅诱导的肺纤维化小鼠尾静脉注射miR-34c-3p和miR-29b-2-5p agomir观察miR-34c-3p和miR-29b-2-5p对纤维化的干预效果。发现过表达miR-34c-3p和miR-29b-2-5p后,与对照组比,干预组中羟脯氨酸含量、EMT和纤维化标志物水平均显著降低,肺泡结构明显改善,纤维化评分分析差异具有显著性。说明miR-34c-3p和miR-29b-2-5p能够缓解小鼠模型中的肺纤维化。6.miR-29b-2-5p和miR-34c-3p联合抑制EMT改善肺纤维化在细胞水平单独或者同时过表达miR-34c-3p和miR-29b-2-5p,结果显示同时过表达这俩个miRNA可以更显著地降低Fibronectin、α-SMA和Vimentin表达,而增加E-cadherin表达,减轻肺上皮细胞的EMT过程,说明这两个miRNA对肺上皮细胞的EMT有联合抑制作用。在动物水平通过腺病毒过表达小鼠肺组织内miR-34c-3p或miR-29b-2-5p,可以抑制矽尘诱导的小鼠肺纤维化,而同时过表达miR-34c-3p和miR-29b-2-5p的纤维化抑制效果更为显著。以上所有结果证明miR-34c-3p和miR-29b-2-5p联合抑制肺上皮细胞的EMT进展,从而改善小鼠肺纤维化。结论本研究证明了lncRNA-ATB可吸附结合miR-34c-3p和miR-29b-2-5p,通过MEKK2、Notch2信号通路参与调控EMT过程,并且miR-34c-3p和miR-29b-2-5p可以共同抑制这一过程。