论文部分内容阅读
(目的)毛囊是皮肤的附属微型器官之一,其在胚胎发育期间开始形成,并在出生后完成形态发生。毛囊的生长呈周期性,毛发生长周期的组成包括生长期、退行期及休止期。毛发周期功能障碍会导致毛囊相关疾病,包括脱毛和多毛症。本试验旨在通过探究C57BL/6小鼠过表达KLF4后对其毛囊生长发育的影响,初步阐明KLF4在毛囊生长发育中机制,从而为进一步完全阐明毛发生长发育机制、运用细胞及分子生物学手段调控动物毛发生长提供试验及理论基础。（方法）从含有目的基因的质粒克隆模板中用PCR法提取目的基因,酶切载体。纯化PCR产物,然后将该产物和线性化的载体连接转化为细菌感受态细胞,先用酶切法对培养出的克隆进行鉴定,然后进行测序、分析和比对阳性克隆,无内毒素高纯度提取制备好的腺病毒颗粒的穿梭质粒及其主干质粒,连续三代重复扩增收集病毒,在293A细胞中测定并标定病毒滴度。试验分为3组,依次作为试验组（Ad-KLF4组,即腺病毒载体编码小鼠KLF4 c DNA组）、对照组（Ad-NC组,即腺病毒载体编码绿色荧光蛋白GFP组）和空白组（不做任何处理）。将小鼠背部皮肤脱毛,分三点皮内注射25μL 1×1010PFU/m L腺病毒载体（Ad-KLF4或Ad-NC）,在给药后的指定时间点采集背部皮肤用于分子生物学与组织学分析。在过表达后24 h采集小鼠注射部位背部皮肤,q RT-PCR、Western bloting检测Ad-KLF4组、Ad-NC组、空白组KLF4 m RNA及蛋白表达量,免疫组化检测KLF4在不同组别中的定位,证明KLF4是否成功转染至小鼠皮肤。在过表达后3、5、7、10、14 d观察小鼠背部毛发生长状况,并拍照记录。HE染色分别观察Ad-KLF4组、Ad-NC组、空白组小鼠毛囊不同时期的毛囊形态。q RT-PCR检测β-catenin、LEF1、Ki67毛囊再生前期（3 d）、中期（7 d）、后期（14 d）m RNA相对表达量,Western bloting检测β-catenin、LEF1、Ki67、AE15毛囊再生前期（3 d）、中期（7 d）、后期（14 d）蛋白相对表达,免疫组化检测β-catenin、LEF1、Ki67、AE15在小鼠皮肤毛囊中的定位。（结果）试验结果表明:（1）目的基因已被定向连入目的载体,将PCR产物纯化后,连接线性化的载体,将其产物转化细菌感受态细胞,克隆长出后用酶切鉴定,然后测序、分析、比对阳性克隆,结果比对正确,表明靶基因表达质粒载体构建成功;病毒液经过纯化和浓缩后使其成为高滴度的浓缩病毒液,后者在293A细胞中进行测定及标定,得出扩增所得腺病毒Ad-KLF4及Ad-NC的滴度约达到1×1010PFU/m L。过表达后24 h,Ad-KLF4组KLF4蛋白及m RNA表达量均极显著高于Ad-NC组、空白组（P＜0.01）;免疫组化检测结果表明KLF4在过表达了KLF4的皮肤的毛囊细胞和毛囊间细胞以及表皮均有显著表达,而Ad-NC组的皮肤毛囊中KLF4呈现弱表达;对KLF4在Ad-NC和Ad-KLF4进行光密度值分析表明,KLF4在Ad-NC中的蛋白表达显著低于在Ad-KLF4中的表达（P＜0.05）。至此证明腺病毒成功转染至小鼠皮肤。（2）qRT-PCR和Western bloting检测结果,在过表达后3、7、14 d,Ad-NC组、空白组Wnt通路关键因子β-catenin、LEF1 m RNA与蛋白表达量均极显著高于Ad-KLF4组（P＜0.01）;免疫组化结果显示,在Ad-NC组中,β-catenin主要表达于毛基质（matrix）、内根鞘（Inner Root Sheath,IRS）、外根鞘（Outer Root Sheath,ORS）、皮脂腺;LEF1表达于毛囊基质（matrix）、毛乳头（Dermal Papilla,DP）,而β-catenin、LEF1在Ad-KLF4组中几乎不表达。（3）拍照记录Ad-KLF4组过表达后3、5、7、10、14 d小鼠背部毛发生长状态。结果表明,注射Ad-KLF4小鼠背部区域无毛发生长,而未过表达KLF4区域毛发呈现生长状态,到第14 d,毛发已经长到几乎和未脱毛一致。HE染色结果表明,空白组和Ad-NC组毛囊呈现正常生长发育规律,而Ad-KLF4组一直处于休止期或生长期早期,DP呈球形位于真皮和皮下组织的边缘,无IRS。q RT-PCR结果显示,在过表达后3、7、14 d,Ad-NC组、空白组Ki67 m RNA表达量均极显著高于Ad-KLF4（P＜0.01）;Western bloting结果显示Ki67、AE15蛋白表达量在Ad-NC组、空白组均极显著高于Ad-KLF4组（P＜0.01）;免疫组织化学检测结果显示,在Ad-NC组中,Ki67主要在matrix、皮脂腺中表达;AE15主要表达于IRS,而Ki67、AE15在Ad-KLF4组中几乎不表达。（结论）综上,本试验利用腺病毒过表达载体成功的构建了小鼠背皮过表达KLF4模型。并研究了小鼠背皮过表达KLF4后对小鼠毛囊生长发育的影响。证明了KLF4在小鼠背部毛囊再生过程中下调了Wnt/β-catenin信号通路关键因子,从而抑制了毛囊的生长发育。