论文部分内容阅读
研究目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种与蛋白质稳态失衡有关的神经退行性疾病,主要表现为β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-protein,Aβ）和异常磷酸化Tau蛋白（Phosphorylated Tau protein,p-Tau）的生成增加,突触相关蛋白质的合成减少,以及异常蛋白质清除途径受损。内质网是控制蛋白质稳态的重要细胞器,调控蛋白质的生物合成、折叠、转运和降解的全过程。本研究从内质网蛋白质稳态（Endoplasmic reticulum proteostasis）的角度,探究3个月的中等强度有氧运动对APPswe/PS1d E9（APP/PS1）小鼠学习记忆及AD病理、海马内质网蛋白质折叠相关基因表达、内质网未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）、内质网相关蛋白降解（Endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD）和内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）-细胞自噬偶联的影响,以期为运动预防和缓解AD提供分子和行为学依据。研究方法实验分组:将3月龄雄性APP/PS1转基因小鼠和野生型（Wild Type,WT）小鼠分为4组:野生型对照组（WT-Sed,n=11）、野生型运动组（WT-Exe,n=11）、APP/PS1对照组（APP/PS1-Sed,n=11）和APP/PS1运动组（APP/PS1-Exe,n=11）。运动方案:APP/PS1-Exe组和WT-Exe组小鼠进行3个月的有氧跑台运动,每天45min,每周5天。行为学实验:3个月的运动干预结束后,采用Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习和记忆能力。组织取材:每组取5只小鼠,深度麻醉后经心脏灌注PBS,随后取脑组织。将右侧半脑制成石蜡切片,用于免疫组织化学实验;将左侧半脑的海马组织取出,提取组织总RNA,用于Real-time PCR实验。每组另取6只小鼠,经深度麻醉后处死,取左右双侧海马,提取组织总蛋白,用于ELISA、Western blotting和Simple western实验。分子生物学实验:（1）海马Aβ和p-Tau生成以及突触相关蛋白表达的检测:采用免疫组化检测海马Aβ斑块;ELISA检测海马Aβ40和Aβ42的含量;Western blotting检测海马BACE1、PS1、Tau、p-TauS396、GSK3β、p-GSK3βS9、p-GSK3βY216的蛋白水平;Real-time PCR检测海马KAL7的m RNA水平;Simple Western实验检测海马SYN、PSD95、BDNF、CREB和p-CREBS133的蛋白水平。（2）海马内质网蛋白质折叠和ERS相关分子的检测:采用Real-time PCR检测海马ERO1L、PDIA2、PDIA3、PDIA4、PDIA5、PDIA6、HSPA5、HSP90B1、HYOU1、HSPA1A、HSPA1B、HSP90AB1、HSPH1、HSPA8、CRYAB、DNAJB1、DNAJB2、CNX和CRT的m RNA水平;Simple Western检测海马CNX和CRT的蛋白水平;免疫荧光双标检测海马APP和GRP78的共定位水平。（3）海马内质网UPR信号通路的检测:采用Western blotting和Simple Western检测PERK、p-PERK、e IF2α、p-e IF2α、ATF4、ATF6、IRE1α、p-IRE1α、XBP1、CHOP、CASPASE12、BAX和BCL2的蛋白水平;免疫组化检测海马p-PERK、p-e IF2α、ATF6和p-IRE1α的水平;Real-time PCR检测海马XBP1s的m RNA水平;免疫荧光检测ATF4的核转位;TUNEL荧光检测海马神经细胞凋亡水平。（4）海马ERAD和ERS-细胞自噬偶联的检测:采用Simple Western检测海马AMFR、SYVN1、VCP、DERL2和HERPUD1的蛋白水平;Real-time PCR检测自噬相关基因BECN1、ATG5、ATG7和ATG12的m RNA水平;Western blotting检测海马LC3和P62的蛋白水平;免疫荧光双标检测海马CRT和LC3共定位水平。研究结果（1）定位航行实验结果显示,与WT-Sed组相比,APP/PS1-Sed组小鼠第4和5天的潜伏期显著增加,第3、4和5天的平台象限时间百分比显著降低。与WT-Exe组相比,APP/PS1-Exe组小鼠第3和4天的潜伏期显著增加,第3和4天的平台象限时间百分比显著降低。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠第5天的潜伏期显著降低。空间探索实验结果显示,与WT-Sed组相比,APP/PS1-Sed组小鼠平台穿越次数显著减少。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠平台穿越次数显著增加。与WT-Sed组相比,APP/PS1-Sed组小鼠海马Aβ斑块水平、Aβ40和Aβ42含量、以及BACE1、PS1、p-TauS396和p-GSK3βY216的蛋白水平显著升高,SYN、BDNF和p-CREBS133的蛋白水平、以及KAL7的m RNA水平显著降低。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马Aβ斑块水平、Aβ40和Aβ42含量、以及BACE1、PS1、p-TauS396和p-GSK3βY216的蛋白水平显著降低,p-GSK3βS9、SYN、PSD95、BDNF和p-CREBS133的蛋白水平、KAL7的m RNA水平显著升高。（2）与WT-Sed组相比,WT-Exe组小鼠海马PDIA4、PDIA5和HSPA1B的m RNA水平显著降低;APP/PS1-Sed组小鼠海马PDIA2、PDIA3、PDIA4、PDIA5、PDIA6、HSPA1B、HSPA8、HSP90B1、DNAJB2、CRYAB、CNX和CRT的m RNA水平以及CRT的蛋白水平显著降低;APP/PS1-Exe组小鼠海马ERO1L的m RNA水平显著升高,PDIA3、PDIA4、PDIA5和HSPA1B的m RNA水平显著降低。与WT-Exe组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马ERO1L的m RNA水平和CRT的蛋白水平显著升高,PDIA3、PDIA6和CRT的m RNA水平显著降低。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马ERO1L、PDIA2、PDIA4、PDIA6、HSPA1A、HSPA8、HSP90AB1和DNAJB2的m RNA水平以及CRT的蛋白水平显著升高。与WT-Sed组相比,APP/PS1-Sed组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平显著升高、APP和GRP78的平均荧光强度显著增加;APP/PS1-Exe组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平显著升高。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平显著降低,GRP78的平均荧光强度显著减少。（3）与WT-Sed组相比,APP/PS1-Sed组小鼠海马p-PERK、p-e IF2α、ATF4、p-IRE1、XBP1u、XBP1s、CHOP、CASPASE12和BAX的蛋白水平显著升高,BAX/BCL2比值显著升高,细胞核ATF4的平均荧光强度显著增加,XBP1s的m RNA水平显著升高,海马DG区TUNEL阳性细胞数量显著升高。与WT-Exe组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马ATF6的蛋白水平显著升高。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马p-PERK、p-e IF2α、ATF4、p-IRE1、XBP1s、CHOP、CASPASE12和BAX的蛋白水平显著降低,BAX/BCL2比值显著降低,XBP1s的m RNA水平显著降低,海马DG区TUNEL阳性细胞数量显著降低。（4）与WT-Sed组相比,APP/PS1-Sed组小鼠海马VCP的蛋白水平显著降低,HERPUD1的蛋白水平显著升高;APP/PS1-Exe组小鼠海马DERL2的蛋白水平显著升高。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马VCP和DERL2的蛋白水平显著升高,HERPUD1的蛋白水平显著降低。与WT-Sed组相比,WT-Exe组小鼠海马ATG5的m RNA水平显著升高,ATG7的m RNA水平显著降低;APP/PS1-Sed组小鼠海马BECN1和ATG7的m RNA水平显著降低,ATG12的m RNA水平、LC3Ⅱ和P62的蛋白水平显著升高,海马DG区CRT的平均荧光强度显著降低,LC3的平均荧光强度显著增加;APP/PS1-Exe组小鼠海马ATG7的m RNA水平显著降低,ATG12的m RNA水平显著升高、DG区LC3的平均荧光强度显著增加。与WT-Exe组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马BECN1和ATG5的m RNA水平显著降低,ATG12的m RNA水平显著升高,DG区LC3的平均荧光强度显著升高。与APP/PS1-Sed组相比,APP/PS1-Exe组小鼠海马ATG12的m RNA水平显著升高,P62的蛋白水平显著降低,海马DG区CRT的平均荧光强度显著增加。研究结论3个月的跑台运动可以预防APP/PS1转基因所诱导的小鼠学习记忆缺陷、Aβ和p-Tau生成增加、以及突触相关蛋白表达失调。其生物学机制可能与内质网蛋白质稳态的调节有关,具体表现在:（1）在调节蛋白质合成上,跑台运动不仅可以促进海马内质网蛋白质折叠和质量监控,减少APP在内质网中积累并缓解ERS;而且可以下调IRE1α/XBP1信号,防止ERS的过度激活;以及下调PERK/e IF2α信号,减少Aβ生成相关酶BACE1和PS1的表达、降低GSK3β活性和抑制CHOP凋亡信号,从而减少Aβ、p-Tau生成以及海马神经细胞凋亡;另外,还可以恢复蛋白质的从头合成途径,从而上调突触相关蛋白的表达。（2）在调节异常蛋白质降解上,跑台运动可以促进ERAD的错误折叠蛋白质胞质逆向运输和蛋白酶体降解途径、提高自噬活性并上调CRT介导的ERS-细胞自噬偶联,从而减少AD脑内错误折叠蛋白质的聚集。