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禽流感病毒是一种A型流感病毒,可感染多种不同物种并导致轻微至严重的疾病。自2003以来,禽流感已在70多个国家暴发。H5和H7亚型的高致病性禽流感病毒可引起家禽严重感染,致死率甚至高达100%,偶尔也能感染人并引起临床症状与死亡。1996年在我国大陆鹅群中首次分离出H5亚型高致病性禽流感病毒,自1997年在香港发生了首例人感染该亚型禽流感病毒并导致死亡后,H5N1亚型病毒开始在我国广泛流行。自2015年起,H5N6亚型禽流感病毒成为我国主要流行毒株并引起一系列的疫情,因此H5N6亚型禽流感病毒的起源、致病性及其传播性的变动均引起了社会的普遍关注。为了解20152016年广东地区H5N6亚型禽流感毒株的遗传特性,本研究对分离自鹅的10株H5N6亚型禽流感病毒进行全基因测序,遗传进化分析表明根据抗原性该10株H5N6亚型禽流感病毒的HA基因均属2.3.4.4分支。根据基因来源该10株毒的HA、PA、PB1、M、NP和NS基因均位于由中国、越南、老挝等国家的分离株组成的Mix-like 1进化分支,而其PB2基因均位于由中国、越南、日本等国家的分离株组成的Mix-like 2进化分支。另外,这些毒株的NA基因均属于欧亚分支。因此,该10株病毒为不同基因型之间的重组毒株。这10株毒株的HA蛋白裂解位点均具备多个连续碱性氨基酸序列（RERRRK/GLF）,这符合高致病性禽流感病毒的分子特征。该10株病毒HA的受体结合位点中的226和228位分别为Q和G,这表明其更倾向于结合禽流感病毒受体的2,3-NeuAcGal键。它们的HA和NA蛋白上均存在潜在的糖基化位点。10个分离株中的NA蛋白在5970位均存在12个氨基酸的缺失,NS1蛋白的8084位有5个氨基酸的缺失。在10个毒株中,仅GS116病毒的M2蛋白发生了与金刚烷胺类药物耐药性相关的突变（V27A）。为了研究鹅源H5N6亚型禽流感病毒对鸡的致病性,本研究选取鹅源GS144和GS148毒株分别以104 EID50 0.1 mL/只剂量感染SPF鸡,结果表明它们对鸡呈现出不同的致病性和传播性。感染GS144病毒鸡的死亡率为100%,其肺、肾、肝、气管、脾和脑6种组织器官中的病毒滴度范围为6.83 lg EID508.25 lg EID50,病毒呈现出较强的致病性;感染GS148病毒的死亡率为0%,该6种组织器官中的病毒滴度范围为2.17 lg EID503.83 lg EID50,病毒呈现出较低的致病性。GS144同居组鸡的死亡率为87.5%,该6种组织器官中的病毒滴度范围在7.17 lg EID509.17 lg EID50之间;GS148同居组鸡的死亡率为0%,该6种组织器官中的病毒滴度范围为1.83 lg EID504.17 lg EID50。这说明GS144病毒对鸡的致病性和在鸡群中的传播能力均强于GS148。为了解鹅源H5N6禽流感病毒接种鸡后产生的抗病毒免疫反应和相关抗病毒免疫因子的变化,本研究使用荧光定量PCR的方法检测感染GS144和GS148病毒的鸡肺组织中的MDA5、MAVS、TRAF3、IFN-β、Mx1、IL-6、TLR3等基因mRNA的相对表达量,结果表明接种GS144的鸡肺组织中MDA5、MAVS、TRAF3、IFN-β、Mx1、IL-6和TLR3等基因的表达量分别上调2.66倍、5.35倍、4.01倍、5.84倍、3.53倍、3.32倍和3.50倍;而接种GS148的鸡肺组织中MDA5、MAVS、TRAF3、IFN-β、Mx1、IL-6和TLR3等基因的表达量分别上调1.35倍、1.42倍、1.04倍、1.24倍、1.13倍、1.15倍和1.13倍。因此,GS144和GS148毒株均可激活鸡体内的抗病毒天然免疫反应,但GS144毒株的作用强于GS148毒株。本研究以鸡胚成纤维细胞CEF的cDNA为模板,使用RT-PCR方法克隆出鸡TRAF3序列。序列分析表明鸡TRAF3基因的CDS长1395 bp,编码465个氨基酸。核苷酸序列同源性比对结果表明本实验所克隆出的鸡TRAF3蛋白与绿头鸭TRAF3的核苷酸序列同源性为79%,与人TRAF3的核苷酸序列同源性为66.6%,与鼠TRAF3的核苷酸序列同源性为65.9%。结构预测表明鸡TRAF3的CDS区主要含有2个结构域,即ZN RING结构域（AA52-87）和C端跨膜结构域（MATH）（AA316-439）。为了研究鸡TRAF3在鸡抗病毒天然免疫信号通路中发挥的作用,本研究将克隆出的鸡TRAF3基因连在pCAGGS载体上获得真核表达质粒,该质粒在293T细胞系中可成功表达目的蛋白。在DF-1和CEF细胞中过表达鸡TRAF3蛋白,使用荧光定量PCR的方法检测细胞中OAS、Mx1、IFN-β、IL-6等细胞因子mRNA的相对表达量。结果显示在DF-1细胞中OAS、Mx1、IFN-β和IL-6的表达量分别上调6.72倍、7.78倍、7.33倍和9.04倍,在CEF细胞中IRF3和IFN-β的表达量分别上调1.59倍和1.69倍。因此,过表达鸡TRAF3基因可激活RLRs抗病毒天然免疫信号通路。