血吸虫又称裂体吸虫（Schistosoma）是一类寄生于人体及哺乳动物静脉血管内的寄生虫，引起以免疫病理损伤为主、严重危害流行区社会经济发展和人民身体健康的人畜共患病-血吸虫病（Schistosomiasis）。该疾病在世界范围内广泛分布，有78个国家和地区流行血吸虫病，其中有52个国家属于高危流行区。据WHO报告，2012年全球有约7亿人受血吸虫病威胁，约2.5亿血吸虫病病人，每年至少还有20万人死于血吸虫病。我国流行日本血吸虫病，目前主要流行于长江中下游地区，是我国主要寄生虫病之一。经过50多年血吸虫病防治工作，我国的血吸虫病流行得到有效的控制，目前，上海、浙江、福建、广东和广西5省市区已达到传播阻断标准，四川、云南和江苏3省达到传播控制水平。但截至2012年底，全国仍有病人约24万，有螺面积36.9万公顷，且每年都有新发钉螺地区，严重危害流行区居民健康和经济发展。因此，现阶段血吸虫病仍是我国重要的公共卫生问题。吡喹酮是20世纪70年代研制的抗绦虫药，随后发现其对人体5种主要血吸虫均有杀灭作用，同时由于吡喹酮在治疗血吸虫病中具备高效低毒，服用方便等特点，使其随即取代其他抗虫药物，被WHO推荐为治疗血吸虫的首选口服药物。吡喹酮口服后在消化道内吸收良好，吸收部位主要在小肠，给药5min即可测得原药，1-1.5h血药浓度达峰值，原药半衰期为1-1.5h，大部分由肾脏排泄。虽然对吡喹酮杀灭血吸虫作用机制已有大量研究，但至今仍没有完全阐明，目前对其认知大致可概括为方面，一是对虫体的直接作用，包括对虫体活动的影响、皮层的损害和代谢的影响；二是对宿主免疫效应的依赖性及其协同作用。全世界每年约有2.5亿血吸虫病人需要吡喹酮的治疗，在高危流行区采用吡喹酮周期的、大范围人群化疗是目前全球血吸虫病控制的主要策略，但已有研究报道对同一人群采用吡喹酮反复进行抗虫治疗，有导致血吸虫对吡喹酮产生抗药性风险。1994年，Doenhoff等首次在实验室内采用亚治疗剂量吡喹酮诱导筛选出曼氏血吸虫吡喹酮抗性株，同时，在曼氏血吸虫病流行的非洲和南美洲现场，也发现曼氏血吸虫对吡喹酮的敏感性下降；埃及血吸虫也出现对吡喹酮治疗不敏感的病例报告。2011年，梁幼生等在实验室采用亚治疗剂量吡喹酮同样地诱导出2株日本血吸虫吡喹酮抗性株。迄今为止吡喹酮是目前现场大规模使用的唯一抗血吸虫的治疗药物，由于还没有可完全替代吡喹酮药物及有效的疫苗出现，因此开展对吡喹酮抗性株的相关研究，了解掌握吡喹酮抗性株生物学、免疫学特性，及产生抗性的分子机制等，可对控制吡喹酮抗性的扩散提供资料，同时也为发现和分析药物作用靶点提供新的途径。已有研究证实，曼氏血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株各发育阶段的对吡喹体外反应性均存在显著差异，体内成虫和虫卵阶段对吡喹酮的反应也存在差异；在基因表达水平上，抗性株某些蛋白表达水平要高于敏感株，如ABC转运蛋白和细胞色素-C氧化酶。但目前关于日本血吸虫吡喹酮抗性株的研究资料很少，对日本血吸虫吡喹酮抗性株的免疫学特性研究尚未见专门研究，本研究试图通过对抗性株和敏感株成虫和虫卵的抗原组分，及抗性株和敏感株感染宿主后宿主反应性等进行研究，旨在了解吡喹酮抗性株免疫学特性变化及为抗性机制研究提供实验依据，内容主要分以下3方面：第一部分：日本血吸虫吡喹酮抗性株及敏感株成虫和虫卵抗原组分分析以定量的日本血吸虫尾蚴感染小鼠，感染42天后剖杀，抗凝生理盐水灌注法收集成虫，并取肝脏组织。肝脏组织用组织匀浆机打碎，分别通过120目/25.4mm2和160目/25.4mm2不锈钢网筛分离浓集虫卵。在玻璃匀浆器中加入适量细胞裂解液和成虫或虫卵研磨裂解，超声离心后吸取上清，获相应可溶性蛋白。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶经考马斯亮蓝染色后用Image Lab凝胶图像分析软件进行比较，分析抗性株和敏感株抗原组分及分子量；同时用quantityone分析泳道光密度，比较条带蛋白浓度。结果显示：经电泳分离，雌虫AWA组分可分成21-23条带，雄虫AWA组分可分成26-36条带，SEA组分可分成22-31条带。雌虫与雄虫AWA两者间有较大的差异，其中在40-50kDa和80kDa两区间差别最大；而SEA与AWA亦有较大的差异，尤其是40-50kDa区间，此外，SEA与雄虫AWA在80kDa差异较大，但与雌虫AWA差异不明显。研究提示：吡喹酮抗性株和敏感株各抗原组分间差异不明显，但泳道光密度分析显示，在相同蛋白浓度下，泳道光密度强度存在差异，提示与敏感株相比抗性株存在部分蛋白表达水平的上调和下调，其中以SEA和雌虫AWA较为明显。第二部分吡喹酮对日本血吸虫吡喹酮抗性株及敏感株皮层的损伤小鼠分别感染抗性株和敏感株尾蚴后分为用药组和不用药对照组，用药组于感染后第35-37天分别灌服75mg/kg、300mg/kg吡喹酮，灌服吡喹酮10min和12h后分别解剖小鼠，采用灌注法收集成虫，置预冷4%戊二醛溶液中固定，经梯度浓度丙酮脱水、喷金，用扫描电子显微镜观察虫体皮层超微结构的改变，比较抗性株和敏感株皮层损伤的差异。结果显示：对照雌虫体表光滑，体表无圆凸，部分体壁可见有呈锥状的小棘；对照雄虫体表体棘呈海绵状排列，具有明显而复杂的褶嵴和凹窝，排列成网格状，全身布满隆起的圆凸，其中分布有蒂乳突状感觉器。75mg/kg PZQ处理后，敏感株雌虫虫体体表褶嵴出现局限性水肿，而抗性株则没有明显改变；12h后，敏感株体表可见较多完整或破损的泡状物，而抗性株褶嵴则开始出现少量水肿；300mg/kg PZQ给药10min后，抗性株和敏感株虫体肌肉严重收缩，体表纹理开始紊乱不平滑，对比两者，敏感株体表收缩程度大于抗性株，同时抗性株和敏感株体表均出现因小棘凹陷而致的陷窝，给药12h后，敏感株出现完整或破损的泡状物，而抗性株仅出现完整的泡状物。雄虫在75mg/kg PZQ处理10min后，敏感株虫体皮层出现空泡和完整或破损的泡状物，而抗性株虫体皮层仅出现空泡和少量泡状物；给药12h后，敏感株虫体皮层有广泛的泡状物，并伴有破溃、糜烂和剥落，而抗性株虫体皮层仅在局部出现完整或破损的泡状物；在300mg/kg PZQ处理10min后，敏感株和抗性株虫体因收缩致皮层褶皱纹理紊乱，并有陷窝出现，给药12h后，敏感株虫体皮层褶皱肿胀、融合，并广泛糜烂、剥落，已看不清体表褶皱结构；抗性株虫体虽亦有大量糜烂、剥落，但仍能看清体表褶皱结构。研究提示：吡喹酮对抗性株和敏感株皮层的损伤不相同，敏感株的损伤比抗性株更严重，提示日本血吸虫吡喹酮抗性株对吡喹酮的作用敏感性降低。第三部分吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后宿主辅助性T细胞反应性1吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后对小鼠辅助性T细胞亚群的影响以定量日本血吸虫尾蚴感染小鼠，用药组小鼠于感染第5周灌服300mg/kg吡喹酮，分别于感染后第2周、第5周、第7周和第9周处死小鼠，无菌取脾脏，制备脾单个核淋巴细胞。脾单个核淋巴细胞用PMA和离子菌素在37℃下刺激培养6h，采用流式细胞分析仪分别检测Th1细胞和Th2细胞占CD3+CD8-细胞的比例，本实验以胞内细胞因子染色来区分Th1细胞和Th2细胞，其中以胞内染色IFN-γ阳性的细胞定义为Th1细胞，以胞内染色IL-4阳性的细胞定义为Th2细胞。结果显示：抗性株和敏感株感染后，Th1细胞比例在第2周时所占比例最高，此后降低；Th2细胞比例在感染后前3阶段较低，且变化不明显，在第9周显著升高，抗性株和敏感株在感染后各阶段Th细胞占CD4+细胞比例没有差异（P>0.05）。经吡喹酮治疗后，江苏抗性株在第7周用药组小鼠脾脏Th2细胞比例高于未用药组（P<0.05）；敏感株在第9周用药组小鼠脾脏Th2细胞比例高于未用药组（P<0.05）；而湖南株两者没有差异（P>0.05）。抗性株和敏感株比较，在治疗后均无明显差异（P>0.05）。研究提示：吡喹酮抗性株和敏感株对终宿主T细胞亚群的分化作用无差异；但经吡喹酮治疗后江苏株感染终宿主Th2细胞亚群的分化作用有显著影响，吡喹酮治疗后，Th2细胞亚群所占百分比明显下降。2吡喹酮抗性株及敏感株感染及经吡喹酮治疗后对小鼠辅助性T细胞因子的影响以定量日本血吸虫尾蚴感染小鼠，在感染第5周后300mg/kg吡喹酮灌服用药组，分别于感染后第2周、第5周、第7周和第9周眼眶采血，制备血清。采用BD Cytometric Bead Array Mouse Th1/Th2cytokine kit和流式细胞分析仪测定Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF和Th2类细胞因子IL-4、IL-5的水平。结果显示：江苏抗性株和敏感株感染后，小鼠血清IL-2变化不明显，于第5、7周达最高值；血清IFN-γ于感染后在第5周达高峰，从第7周开始迅速下降；血清TNF持续升高，在感染后第9周达到高峰；IL-4和IL-5都是在第5周达最高峰，其他时间段没有明显变化。抗性株和敏感株比较，实验各阶段敏感株感染小鼠血清IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5都高于抗性株，而TNF在感染2周后抗性株高于敏感株。经分析，江苏抗性株和敏感株感染小鼠后第5周血清IL-4水平差异具有统计学意义（P<0.05）。湖南抗性株和敏感株感染后，小鼠血清IL-2变化不是很明显，于第5、7周达最高值；血清IFN-γ于感染后在第5周达高峰；从第7周开始迅速下降；血清TNF持续升高，在感染后第9周达到高峰；IL-4和IL-5都是在第5周达最高峰，其他时间段没有明显变化。抗性株和敏感株比较，经分析，第5周血清IFN-γ水平不相同（P<0.05），抗性株高于敏感株；第7周血清TNF水平存在差异（P<0.05），抗性株高于敏感株；第2周IL-5存在差异（P<0.05），敏感株要高于抗性株；第5周血清IL-4、IL-5水平存在差异（P<0.05），抗性株要高于敏感株。吡喹酮治疗后，江苏抗性株用药组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平在第7、9周均高于未用药组，TNF水平低于未用药组；而敏感株用药组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平在第7周低于未用药组，于第9周达相同水平，TNF水平则始终低于未用药组。经分析，江苏抗性株用药组和未用药组小鼠血清IL-5在第7周、TNF在第9周差异具有统计学意义（P<0.05）；江苏敏感株用药组和未用药组小鼠血清TNF在第7周和第9周差异均有统计学意义（P<0.05）。湖南株抗性株用药组IL-2、IL-4、IL-5水平在第7、9周均高于未用药组， IFN-γ、TNF水平低于未用药组；而敏感株用药组IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-5水平在第7、9周均低于未用药组。经分析，湖南抗性株用药组和未用药组小鼠血清TNF、IL-5在第7周，IFN-γ、TNF在第9周差异有统计学意义（P<0.05）；湖南敏感株用药组和未用药组小鼠血清IFN-γ、TNF在第7周，IL-2、IFN-γ在第9周差异均有统计学意义（P<0.05）。抗性株和敏感株相比，抗性株感染小鼠血清细胞因子均低于敏感株，其中于用药后第2周，江苏株感染小鼠血清IFN-γ差异具有统计学意义（P<0.05），湖南株感染小鼠血清IL-4、IL-5差异具有统计学意义（P<0.05）。研究显示：吡喹酮抗性株和敏感株感染终宿主后，宿主免疫应答强度不相同，对江苏敏感株的应答强于抗性株；吡喹酮治疗后，机体对抗性株的应答反应则要强于敏感株。结论本研究试图通过比较日本血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株成虫和虫卵的抗原组分差异；观察吡喹酮对于抗性株和敏感株成虫损伤的差异；以及抗性株和敏感株感染后及经吡喹酮治疗后感染终宿主体内免疫反应变化，以探讨日本血吸虫吡喹酮抗性株的免疫学特征，研究显示：两者抗原条带组分无明显差异，但泳道光密度分析显示部分条带光密度值间存在差异，相关抗原蛋白表达量存在上调或下调；吡喹酮对表层损伤程度存在差异，敏感株损伤程度重于抗性株；抗性株和敏感株感染及吡喹酮治疗对辅助性T细胞亚群无明显影响，但感染后宿主免疫应答强度不相同，经吡喹酮治疗后，机体对抗性株的应答反应强于敏感株。