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卵巢上皮性肿瘤（epithelial ovarian cancer,EOC）是妇科肿瘤中病死率最高的一种疾病。由于卵巢解剖位置隐匿、发病早期无征兆及缺乏有效的早期检测诊断方法,所以患者一经发现约70%80%已处于中晚期,且存在广泛的腹腔转移或远处转移,严重威胁妇女健康。根据最新NCCN指南,EOC的治疗原则仍是手术为主、辅以化疗等综合治疗。随着化疗方案的改进,尽管以铂类为基础的化疗有效率达70%80%,但是在这部分患者中,即使达到临床完全缓解,最终仍有约70%患者在规范化治疗后的2年内出现复发,上皮性卵巢癌患者的5年生存率始终徘徊在30-40%左右。而复发的卵巢癌患者常伴有铂类药物的耐药,研究显示化疗耐药是导致卵巢癌治疗失败的主要原因。因此深入研究EOC耐药的相关分子机制,是提高治疗效果,评估耐药及预测预后的关键。Twist即碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix.bHLH）转录因子,现在研究表明Twist作为一种进化过程高度保守的致癌基因,参与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的全过程,文献显示可在多种恶性肿瘤中检测到Twist蛋白高表达,并且与癌症的发生发展、耐药及预后相关。国内外已有Twist基因在卵巢肿瘤中的相关报道,但在卵巢上皮性癌中的研究甚少,Twist与上皮性卵巢癌的发生发展、复发及耐药的机制仍不甚明确。由于卵巢癌的耐药机制及如何解决临床患者化疗耐受的问题一直是卵巢癌基础研究和临床研究的重点和难点,所以我们选择Twist基因表达与上皮性卵巢癌耐药及预后关系课题进行研究。本课题从组织学、细胞学水平着手研究,希望了解Twist在EOC中的表达与临床病理特征、化疗耐药及与预后的关系,并对其分子生物学机制进行初步探讨。本课题研究分两个部分:1、免疫组织化学法检测Twist在上皮性卵巢癌中的表达与化疗耐药及预后的关系;2、上皮性卵巢癌细胞株A2780中的Twist表达与顺铂化疗耐药的关系。研究目的1、检测卵巢上皮性癌组织中Twist蛋白表达2、结合临床资料分析Twist表达状况与临床病理特征、肿瘤耐药及预后的相关性3、利用si-RNA干扰技术,研究卵巢细胞株Twist蛋白表达变化对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响,探讨Twist与铂类药物敏感耐药的分子生物学可能机制研究方法1.查阅2011年至2016年西京医院妇科卵巢病变患者共计4115例,筛选收集上皮性卵巢癌患者590例。按照原发EOC患者,我院初诊治疗,术后以铂类为基础的规范化疗≥4次的纳入标准,采用构成随机抽样方法抽取上皮性卵巢癌患者101例。在因宫颈上皮内瘤变行全子宫+双附件切除的患者中,简单随机方法抽取20例卵巢组织正常患者。参照2014年WHO卵巢癌组织学分类[1]、2015年国际妇产科联合会FIGO分期[2]、根据2018年NCCN指南[3],将卵巢癌患者进行临床特征分组,根据化疗效果分为化疗敏感组及化疗耐药组。收集完整的随访资料。2.免疫组织化学染色检测石蜡组织切片中Twist在卵巢正常组织及上皮性卵巢癌组织中的表达状况。3.结合临床资料分析Twist表达状况与不同年龄、病理分期、病理分级、病理类型、FIGO分期、有无腹水、有无淋巴结转移及铂反应的关系。4.结合随访资料绘制Twist不同表达时,患者生存曲线图,采用COX单因素分析影响患者预后的危险因素,有统计学差异的再进行多因素COX模型分析。5.根据前期预实验,培养人卵巢癌细胞株A2780,设计小干扰RNA,筛选Twist-siRNA逆转录表达于A2780细胞株。6.下调A2780中Twist的表达,通过CCK-8细胞增殖实验和流式细胞凋亡实验探讨Twist与顺铂药物的关系。7.检测转染Twist-siRNA已下调Twist的EOC细胞株A2780表达,通过RT-PCR和Western-blot结果探讨Twist与顺铂药物的关系。结果1.与正常卵巢组织相比,卵巢上皮性癌组织中的Twist呈高水平表达。2.卵巢上皮性癌癌组织中Twist的表达水平与患者的FIGO分期（P=0.006）、是否伴有淋巴结转移（P=0.046）、铂类耐药（P=0.026）相关。Twist的表达水平的差异与患者的年龄、病理分级、病理类型及有无腹水不相关（P>0.050）。3.生存曲线图显示Twist高表达患者的无进展生存期（PFS）及总生存（OS）期短。4.COX回归模型逐个进行COX单因素分析,显示年龄、病理分级、病理分型及腹水不是预后的危险因素（P≥0.05）;肿瘤复发、FIGO分期、淋巴结转移、铂类药物反应及Twist高表达是预后的危险因素（P<0.05）;对以上危险因素组建COX模型进行多因素分析,显示耐药复发是EOC患者预后的独立危险因素（P<0.05）。5.构建Twist-siRNA成功,Twist-siRNA-771用于后续实验研究。6.卵巢上皮性癌A2780细胞转染Twist-siRNA后,实验显示细胞的增殖率降低,凋亡率增加,对顺铂药物的敏感性增加。结论1.Twist高表达与上皮性卵巢癌相关。2.Twist高表达的上皮性卵巢癌可能更具侵袭性。3.Twist高表达患者易出现铂类耐药。4.Twist高表达患者的预后差。5.下调Twist后抑制卵巢癌细胞A2780增殖,促进其凋亡。6.下调Twist后增加卵巢癌细胞A2780对顺铂的敏感性。7.临床免疫组织化学实验的结果与体外细胞实验结果相一致。