【摘 要】
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背景痛风性关节炎是由于尿酸单钠晶体（monosodium urate,MSU）引起的急性炎性关节疾病,是成年男性中最常见的炎症性关节炎。目前研究表明,MSU作为危险相关分子模式（danger-associated molecular patterns,DAMPs）可被细胞膜及细胞质中的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）识别,进而激活TLR4/NF-
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背景痛风性关节炎是由于尿酸单钠晶体（monosodium urate,MSU）引起的急性炎性关节疾病,是成年男性中最常见的炎症性关节炎。目前研究表明,MSU作为危险相关分子模式（danger-associated molecular patterns,DAMPs）可被细胞膜及细胞质中的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）识别,进而激活TLR4/NF-κB,NLRP3炎性通路。核苷酸结合寡聚化结构域蛋白（nucleotide-binding oligomerization domaincontaining protein 2,NOD2）作为典型的PRRs,可识别病原体中的病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）和DAMPs,在与配体结合后,通过激活NOD2/NF-κB和丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路介导炎症因子的释放。越来越多的研究表明NOD2与慢性炎症性疾病有关,例如克罗恩病、Blau综合征和早发结节病。然而NOD2是否参与痛风炎症反应尚未有文献报道。目的探讨NOD2在MSU诱导的痛风炎症中致病的分子机制。方法1.构建雄鼠C57BL/6急性痛风气囊模型,通过向气囊内注射si RNA、慢病毒分别敲低、过表达NOD2蛋白。向气囊内注射MSU刺激8h后处死小鼠,回收气囊内灌洗液及细胞。对气囊灌洗液的白细胞计数、收集灌洗液中白细胞通过Q-PCR检测M1型巨噬细胞表面特异性标志物（i NOS,CD86）相对表达量,并且使用ELISA试剂盒检测灌洗液中炎症因子白介素1β（interleukin 1 beta,IL-1β）、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）的含量。收集气囊滑膜,多聚甲醛固定,免疫组化检测滑膜组织F4/80,NF-κB磷酸化水平。HE染色检测气囊滑膜组织中炎性细胞的浸润。2.构建THP-1炎症细胞系。转染si RNA、慢病毒分别敲低、过表达NOD2蛋白。在MSU的刺激下,ELISA检测THP-1细胞上清中炎症因子IL-1β,MCP-1的表达量。western blotting检测THP-1细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平、caspase-1蛋白的活化。通过体外实验探讨NOD2参与MSU诱导的炎症反应,并初步研究NOD2调控痛风发病的炎症机制。结果1.（1）通过小鼠气囊模型发现,在NOD2敲低实验中,MSU-NOD2-si RNA组小鼠气囊灌洗液中白细胞计数、M1型巨噬细胞表面特异性标志物（i NOS,CD86）表达水平和炎性因子IL-1β、MCP-1的表达水平明显低于MSU-NC组小鼠。小鼠气囊滑膜组织免疫组化结果显示,MSU-NOD2-si RNA组小鼠的滑膜组织中F4/80、NF-κB磷酸化水平较MSU-NC组明显减少。HE染色结果表明MSU-NOD2-si RNA组小鼠的滑膜组织炎症细胞的浸润较MSU-NC组明显减少。（2）在NOD2过表达实验中,MSU-NOD2-LV小鼠气囊灌洗液中白细胞计数、M1型巨噬细胞表面特异性标志物表达水平和炎性因子IL-1β、MCP-1的表达水平明显高于MSU-NC组。小鼠气囊滑膜组织免疫组化图像显示,MSU-NOD2-LV组小鼠的滑膜组织F4/80,NF-κB磷酸化水平较MSU-NC组明显增高。HE染色得出MSU-NOD2-LV组小鼠的滑膜组织炎症细胞的浸润较MSU-NC组明显增高。2.（1）通过敲低THP-1细胞中NOD2蛋白,我们发现在MSU刺激后,MSU-NOD2-si RNA组THP-1细胞的NF-κB蛋白磷酸化、caspase-1活化水平明显低于MSU-NC组。（2）通过慢病毒转染THP-1细胞,过表达NOD2蛋白,我们发现在MSU刺激后,MSU-NOD2-LV组THP-1细胞NF-κB蛋白磷酸化、caspase-1活化水平明显低于MSU-NC组。结论本研究首先在痛风患者中发现NOD2在RNA水平的高表达。然后通过体外细胞和体内动物实验,发现NOD2通过调节MSU刺激下炎症因子的表达而参与痛风炎症反应。进一步研究表明NOD2通过调控NF-κB蛋白磷酸化水平以及caspase-1的活性影响巨噬细胞的功能。本课题初步探讨了MSU诱导的炎症过程中NOD2发挥的调控作用,补充了痛风的炎症调控机制,为痛风进一步的研究及治疗提供新的方向。
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