论文部分内容阅读
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一系统性自身免疫性疾病,以关节为主要损伤靶点,呈反复活动性发作,最终造成关节破坏。类风湿关节炎患病率0.34%-0.36%,非正规治疗2-3年致残率50-70%。类风湿关节炎患者主要痛苦为关节疼痛及关节功能丧失,其主要原因除了严重关节炎症反应外,近些年发现周围神经损伤在给患者带来痛苦及关节功能丧失中亦起到了重要作用。类风湿关节炎神经系统损害可涉及周围神经、中枢神经、植物神经和肌肉等。研究发现类风湿关节炎中周围神经损伤的机制可能不同于关节炎的致病机制,所以研究类风湿关节炎并发周围神经病变的机制对于其诊断和治疗具有重要的意义。微小RNA(microRNA,miRNA)被证实为一类广泛存在于真核生物中的单链非编码蛋白质的小分子RNA,通过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解靶mRNA,是一种起负调控作用的分子。目前研究显示miRNA参与了生物体生长、发育、分化、免疫应答等生理过程,且其表达及功能失调可能导致肿瘤、自身免疫/炎症性疾病、神经退行性疾病等多种病理现象。目前国际报道至少10余种miRNA在类风湿关节炎中异常表达,而我国学者利用miRNA芯片技术在类风湿关节炎患者血浆中筛选出9种特异性表达的miRNA,其中miR-122-3p、miR-3926、miR-9-5p、miR-3925-3p、miR-342-3p 和 miR-219-2-3p 表达下调,而 miR-4764-5p、miR-181d和miR-4634表达上调,进一步分析发现部分miRNA与炎症因子水平相关。miRNA在髓鞘形成及Schwann细胞的分化中起到重要作用,然而miRNA与类风湿关节炎并发周围神经病变的关系研究尚少。探讨miRNA与类风湿关节炎并发周围神经病变的关系有利于疾病的诊断与治疗。本研究通过对前期利用qRT-PCR技术筛选出可能参与类风湿关节炎周围神经病变的miRNA,预测分析与类风湿关节炎周围神经病变的miRNA相关的靶基因;通过构建炎性条件下不同Schwann细胞模型,对Schwann细胞损伤的测定来验证该miRNA在炎症所致的周围神经损伤中的作用;进一步分析该miRNA下游调控的基因,构建该miRNA调控类风湿关节炎周围神经病变的网络,为类风湿关节炎周围神经病变的临床诊断、治疗提供新的方法。第一部分miRNA在类风湿关节炎并发周围神病变患者中的表达分析目的:检测类风湿关节炎患者临床样本中miR-9-5p、miR-342-3p、miR-122-3p、miR-219-2-3p和miR-181a的表达水平。方法:1.收集类风湿关节炎并发周围神经病变组(RA+PNP组)及未发生周围神经病变的类风湿关节炎组(RA组)患者的外周血;2.利用real-time PCR的方法检测类风湿关节炎患者临床样本中miR-9-5p、miR-342-3p、miR-122-3p、miR-219-2-3p和miR-181a的表达情况。结果:1.共收集RA+PNP组15例及RA组16例;2.与RA组患者相比,RA+PNP组的外周血中,miR-9-5p和miR-342-3p的表达量显著降低;miR-122-3p、miR-219-2-3p的表达量无显著变化;miR-181a的表达量显著升高。结论:miR-9-5p和miR-342-3p表达与类风湿关节炎并发周围神经病变呈负相关,miR-181a的表达与类风湿关节炎并发周围神经病变呈正相关,其中miR-9-5p与类风湿关节炎并发周围神经病变相关性最为显著。第二部分 miR-9-5p在类风湿关节炎并发周围神经病变中的功能分析目的:验证miR-9-5p在Schwann细胞损伤模型中的作用及调控的靶基因。方法:1.利用TNF-α联合IL-6刺激构建炎症条件下Schwann细胞模型;2.利用CCK-8试剂盒检测不同细胞模型组的细胞进行TNF-α联合IL-6刺激后0h、24h、48h、72h的细胞活性情况;3.利用流式细胞仪对不同细胞模型组的细胞进行TNF-α联合IL-6刺激24h后流式检测;4.利用real-time PCR和Western blot检测miR-9-5p和REST的表达水平;5.利用荧光素酶报告系统检测miR-9-5p对REST基因的靶向调控。结果:1.与对照组相比,TNF-α联合IL-6刺激组的细胞活性在TNF-α联合IL-6刺激后24h、48h、72h均显著降低;刺激24h后细胞凋亡增加;2.与对照组相比,TNF-α联合IL-6刺激组的miR-9-5p表达显著下降;3.与RA组相比,RA+PNP组患者细胞中REST表达水平显著提高;REST在RA+PNP组中的表达水平变化与miR-9-5p的表达水平变化呈负相关;TNF-α联合IL-6刺激组Schwαnn细胞中REST表达水平显著高于对照组;4.与对照组性比,TNF-α联合IL-6 +miR-9-5p mimics组及TNF-α联合IL-6+si-REST组的细胞活性在TNF-α联合IL-6刺激后48h、72h后活性均显著降低,24h时凋亡增加;与TNF-α联合IL-6+转染对照组相比,TNF-α联合IL-6 +miR-9-5p mimics组及TNF-α联合IL-6+si-REST组的细胞活性在TNF-α联合IL-6刺激后48h、72h后活性均显著升高,凋亡减少;5.与对照相比,在野生型REST细胞中施加miR-9-5p mimics后,LUC相对活性显著降低;而在突变型REST细胞中施加miR-9-5p mimics后,LUC相对活性则无明显变化;6.与 TNF-α联合 IL-6 + 转染对照组相比,miR-9-5p 在 TNF-α联合 IL-6 +miR-9-5p mimics组中的表达量显著提高;REST在TNF-α联合IL-6 +miR-9-5p mimics组及TNF-α联合IL-6+si-REST组中的表达量显著降低。结论:1.miR-9-5p表达量的变化对Schwann细胞的活性与凋亡具有重要作用;2.REST与miR-9-5p呈负相关,REST作为miR-9-5p的靶标在炎症所致周围神经损伤中起作用;3.过表达miR-9-5p或干扰REST都可降低炎性条件下Schwann细胞的损伤,表明miR-9-5p通过调控REST基因的表达进而影响周围神经细胞的状态,这也可能是类风湿关节炎并发周围神经病变的机制之一第三部分miR-132在类风湿关节炎并发周围神经病变中的功能分析目的:通过体外细胞模型的建立证明miR-132在类风湿关节炎并发周围神经病变中的功能及分子通路。方法:1.利用qRT-PCR和Western blot方法检测miR-132、EP300、PTEN及F〇X03在不同细胞模型中的表达分析;2.利用CCK-8试剂盒检测不同细胞模型组的细胞进行TNF-α联合IL-6刺激后Oh、24h、48h、72h的细胞活性情况;3.利用流式细胞仪对不同细胞模型组的细胞进行TNF-α联合IL-6刺激24h后流式检测。结果:1.在TNF-α联合IL-6+miR-9-5p mimics组和TNF-α联合IL-6 +si-REST组,Schwann细胞中miR-132的表达量显著升高;而EP300、PTEN和F〇X03的表达量则显著下调;2.与TNF-α联合IL-6 +转染对照组相比,在诱导48h和72h时,TNF-α联合IL-6 +miR-132 mimics组和TNF-a联合IL-6+si-REST组细胞活力显著提高;相反,TNF-α联合IL-6+si-REST组+miR-132 inhibitor组细胞的细胞活力显著降低,凋亡增加;3.与TNF-α联合IL-6 +转染对照组相比,TNF-α联合IL-6 + miR-132 mimics组和TNF-α联合IL-6+si-REST组EP300、PTEN及FOX03的蛋白表达显著降低;相反,TNF-α联合IL-6+si-REST组 +miR-132 inhibitor组EP300、PTEN及F〇X03 的蛋白表达显著增高。结论:过表达miR-9-5p或干扰REST都可以促进miR-132表达,miR-132的高表达抑制了EP300,PTEN及FOXO3的表达,该过程可能参与神经细胞的保护作用,防止类风湿关节炎并发周围神经病变。