肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1由163个氨基酸残基组成,包含N端负责特异性识别并结合磷酸化底物的WW结构域和C端负责对磷酸化底物进行催化异构化的PPIase结构域,其是一种相对较小的酶。Pin1能够特异的识别和结合含有p Ser/Thr-Pro基序的蛋白,并对其催化异构化。同时,Pin1参与多条信号通路的调控,在致癌信号通路中发挥着整合、翻译和放大等作用,并且在多种肿瘤细胞中过表达。越来越多的研究表明抑制Pin1可以抑制多条致癌信号通路,因此Pin1有望成为新的肿瘤诊断和治疗的理想靶标。c-Jun是二聚体转录因子激活蛋白1（AP-1）的主要成分,它参与许多细胞活动,例如增殖、凋亡、存活、肿瘤发生和形态组织发生。c-Jun丰度和活性的失调与多种类型的癌症相关。有研究表明,Pin1介导的脯氨酰顺反异构化会影响底物稳定性,Pin1会保护c-Jun免受泛素介导的降解。因此,了解Pin1对磷酸化c-Jun的作用机理,就有望基于此催化机理找到抑制Pin1的方法。本文利用配有超低温探头的700MHz液体核磁共振仪,以Pin1和单/多位点磷酸化多肽c-Jun为对象,探究Pin1对其磷酸化底物c-Jun的结合和催化机理。在25℃条件下,通过二维~1H-15N HSQC化学位移扰动滴定实验,研究Pin1两个结构域与单/多位点磷酸化多肽c-Jun的结合活性位点;二维~1H-~1H ROESY实验,研究PPIase结构域对单/多位点磷酸化多肽c-Jun催化异构化效率;二维NOE实验,判断Pin1结构骨架的刚性,推测Pin1对多位点磷酸化c-Jun的催化机理,具体内容如下:（1）提出了Pin1与多位点磷酸化c-Jun的四态结合模型。将Pin1 WW结构域蛋白、Pin1 PPIase结构域蛋白和Pin1全长蛋白分别与单位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63、c-Jun p Ser 73和双位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63-p Ser 73进行滴定实验。首次在Pin1全长蛋白上同时观测到WW结构域和PPIase结构域上与底物的结合活性位点,发现Pin1蛋白与单/多位点磷酸化多肽c-Jun结合时单独的WW结构域与磷酸化底物c-Jun结合的亲和力要低于单独的PPIase结构域对磷酸化底物c-Jun的亲和力;而当两个结构域同时存在时,WW结构域对磷酸化底物c-Jun的亲和力大幅提升,同时WW结构域还会一定程度上与PPIase竞争结合底物;多位点磷酸化底物c-Jun在与Pin1蛋白相互作用时亲和力则得到了显著提升,并确定了Pin1与多位点磷酸化多肽的四态结合模型。（2）推测了Pin1对多位磷酸化c-Jun的催化机理。将Pin1 PPIase结构域蛋白和Pin1全长蛋白分别与单位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63、c-Jun p Ser 73、c-Jun D 63-p Ser73和双位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63-p Ser 73进行~1H-~1H ROESY实验,并通过NOE实验确定了PPIase结构域为刚性骨架。得到单位点磷酸化多肽c-Jun在与Pin1蛋白催化异构化时,WW结构域的存在会削弱PPIase结构域对底物肽键催化异构化的效率,且p Ser73底物具有极低的催化异构化效率。c-Jun D 63-p Ser 73多肽与蛋白催化异构化时,p Ser73异构化速率大大提升,c-Jun p Ser63-p Ser73与蛋白催化异构化时,p Ser 73异构化速率进一步提升。因此,底物中63位残基的存在及p Ser 63的异构化会促进73位残基的催化异构化。推测了Pin1与底物结合会促进催化异构化的可能原因为结合可能具有记忆性。本论文所提出的Pin1与多位点磷酸化多肽c-Jun的结合及催化异构化机理,为进一步对Pin1支链结构参与多位点磷酸化多肽c-Jun催化过程的研究提供了基础,同时也为Pin1针对不同磷酸化底物的催化机理提供了思路。