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第一部分CKD患者肾小管上皮细胞程序性坏死在肾小管间质纤维化的作用及其与TGF-β1/Smads信号分子相关性目的:明确不同分期慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者肾小管上皮细胞程序性坏死在CKD进展中的意义,进一步探讨CKD患者肾小管上皮细胞程序性坏死与成纤维细胞的活化、上皮间充质转化及TGF-β1/Smads信号分子表达相关性。方法:1、收集2020年3月至2021年3月于海南医学院第一附属医院和新乡医学院第一附属医院行肾活检且估算肾小球滤过率（e GFR）≥15 ml·min-1·（1.73 m~2）-1的100例18～65岁CKD患者的临床资料和肾组织活检标本。2、按照改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease:Improving Global Outcomes,K/DOQI）指南分为CKD1-4期,CKD1期、2期和4期每期20名,CKD3期40名患者,以不伴有基础肾脏疾病的肾外伤15名患者为对照组。3、采用透射电镜观察各期肾组织中发生程序性坏死的肾小管上皮细胞及其周围间质成纤维细胞形态结构。4、采用HE染色和PASM染色方法观察各期患者肾组织病理变化及肾脏纤维化程度。5、采用免疫组化技术检测不同时期CKD患者肾组织程序性坏死关键信号分子（RIP3、MLKL、p-MLKL）,促纤维化因子及信号分子（TGF-β1、Smad2、Smad3）及间质成纤维细胞活化标志物（FGF-2、FSP1、Collagen-I）和肾小管上皮细胞间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）标志分子（E-cadherin、a-SMA）蛋白的表达,并比较其差异。6、采用免疫荧光技术检测不同时期CKD患者肾组织中TUNEL+RIP3、TUNEL+MLKL、TUNEL+TGF-β1、TUNEL+FSP1、TUNEL+Collagen-I、TUNEL+E-cadherin和TUNEL+a-SMA蛋白的表达,并比较其差异。7、采用双标免疫荧光染色法检测对照组和CKD患者肾组织中RIP3和TGF-β1、RIP3和Collagen-I共定位情况,并比较其差异。8、Pearson相关分析肾小管上皮细胞程序性坏死与CKD患者临床病理指的相关性。结果:1、随着CKD进展,估计肾小球滤过率（estimate glomerular filtration rate,e GFR）逐渐下降,而胱抑素C（Cystatin C,Cys C）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、血肌酐（Serum creatinine,Scr）、24小时尿蛋白定量和收缩压逐渐升高,CKD3期、4期与对照组比较有显著差异（P＜0.01）。2、在透射电镜观察下,人肾组织中肾小管上皮细胞出现典型的坏死形态学特征,可见细胞体积增大,细胞和细胞器发生明显肿胀,细胞膜破裂,胞浆内容物外溢,伴有细胞内广泛囊泡的形成。3、HE染色和PASM染色,结果显示,随着CKD进展,CKD患者肾小管的结构破坏逐渐加重,出现相应区域的肾小管萎缩,伴间质纤维化,相邻区域肾小管灶性扩张、肾小管内可见大量蛋白管形,CKD2、3a期患者肾小管损伤分数明显高于对照组（均P＜0.01）,在CKD3b、4期有所下降;肾间质纤维化程度逐渐加重。4、免疫组化结果显示,CKD患者肾组织RIP3和MLKL及p-MLKL蛋白主要表达于肾小管上皮细胞胞浆内,在CKD2、3a期患者肾小管上皮细胞胞浆表达明显增高（均P＜0.01）;与正常对照组相比,CKD2和3a期患者促纤维化因子及信号分子TGF-β1、Smad2、Smad3和间质成纤维细胞活化标志物FGF-2、FSP1、Collagen-I及肾小管上皮细胞EMT标志分子a-SMA蛋白水平明显增加（均P＜0.01）,而E-cadherin蛋白表达明显降低（P＜0.01）。5、免疫荧光染色结果显示:在CKD2、3a期患者肾小管上皮细胞TUNEL+RIP3+、TUNEL+MLKL+双阳性肾小管上皮细胞（程序性坏死细胞）百分率明显增高（均P＜0.01）。与正常对照组相比,CKD2和3a期患者TUNEL+TGF-β1、TUNEL+FSP1、TUNEL+Collagen-I和TUNEL+a-SMA蛋白水平明显增加（均P＜0.01）,而E-cadherin蛋白表达明显降低（P＜0.01）。与对照组比较,CKD组患者RIP3和TGF-β1、RIP3和Collagen-I共表达阳性（P＜0.01）。6、Pearson相关分析结果显示,肾小管上皮细胞程序性坏死百分数与TGF-β1、Collagen-I及肾小管损伤分数、肾间质纤维化指数均呈正相关,与e GFR呈负相关。结论:1、在CKD进展中,CKD患者肾小管上皮细胞的确发生了程序性坏死,且高峰期在CKD2和3a期。2、CKD患者肾小管上皮细胞程序性坏死可能与促纤维化因子及信号分子TGF-β1、Smad2/3表达、间质成纤维细胞的激活及肾小管上皮细胞EMT发生相关。第二部分:TNF-α在体外诱导HK-2发生程序性坏死激活间质成纤维细胞及其可能机制目的:在细胞水平阐明肾小管上皮细胞程序性坏死通过TGF-β1/Smad3信号通路促进成纤维细胞活化和上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transformation,EMT）介导CKD肾小管间质纤维化。方法:1、分别用正常培养基及含有TNF-α（100ug/L）处理HK-2细胞,24小时后收集细胞,将HK-2细胞分为正常对照（control）组、TNF-α组,再把TNF-α组分为TNF-α+Nec-1s组、TNF-α+GSK,872组、TNF-α+NSA组,分别给予Nec-1s、GSK,872、NSA预处理30min,采用Western blot（WB）检测HK-2细胞RIP3、MLKL、TGF-β1和Smad3蛋白表达水平并比较其差异。2、100ug/L TNF-α诱导HK-2细胞24小时,构建肾小管上皮细胞程序性坏死模型,分别用正常培养基及发生程序性坏死HK-2细胞上清液与间质成纤维细胞（h RIFs）共培养,48h后收集细胞。将HK-2细胞分为对照组、TNF-α+Nec-1s组、TNF-α+GSK,872组、TNF-α+NSA组,后三组分别给予Nec-1s、GSK,872、NSA预处理30min,采用Western blot（WB）检测HK-2细胞FGF-2和FN蛋白表达水平并比较其差异。再将HK-2细胞分为对照组、vehicle组、LY364947组、SIS3组和FGF-2 antibodies组,分别给予LY364947、SIS3及FGF-2 antibodies预处理30min,采用Western blot（WB）检测HK-2细胞FGF-2、FN、及α-SMA蛋白表达水平并比较其差异,明确肾小管上皮细胞程序性坏死与间质成纤维细胞的活化及肾小管上皮细胞EMT相关性。结果:1、细胞实验Western blot结果显示,与正常对照组相比,TNF-α诱导的HK-2细胞中程序性坏死标志性分子RIP3和MLKL蛋白明显增多（P＜0.05）;促纤维化因子及信号分子TGF-β1和Smad3蛋白水平明显增高（P＜0.05）,且Nec-1s、GSK,872和NSA均降低了HK-2细胞RIP3、MLKL、TGF-β1和Smad3蛋白水平。2、Western blot结果显示,与对照组相比,vehicle组间质成纤维细胞活化标志物FGF-2和FN蛋白水平明显增多（P＜0.01）;肾小管上皮细胞间充质转化标志分子α-SMA蛋白水平增高（P＜0.05）,且LY364947、SIS3和FGF-2 antibodies有效降低α-SMA蛋白表达水平,Nec-1s、GSK,872、NSA、LY364947、SIS3和FGF-2 antibodies均有效抑制FGF-2及FN而蛋白表达水平（均P＜0.01）。结论:在CKD进展中,患者肾小管上皮细胞发生了程序性坏死,程序性坏死可能通过介导促纤维化因子TGF-β1及信号分子Smad2/3,促进间质成纤维细胞的激活及肾小管上皮细胞EMT发生,促进TIF发生、发展。