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研究背景和目的长期以来中枢神经系统被认为是一个免疫特免器官,缺少外周免疫细胞、与免疫相关的部分细胞因子及血浆蛋白。然而1964年Scheinberg等的脑肿瘤移植实验中证实,移植部位周围有轻度的淋巴细胞浸润及小胶质细胞增生,提示中枢神经系统并非绝对免疫特免器官。小胶质细胞在中枢神经系统的免疫监督中具有关键作用,但近年来随着分子生物学的发展,人们发现小胶质细胞还与胶质瘤的发展密切相关。脑胶质瘤是人神经系统中发病率最高、恶性程度最高、预后最差的一种恶性肿瘤。随着医疗技术的发展,虽然目前胶质瘤的诊断和治疗方法有了较大的进步,但疗效尚不令人满意,大部分恶性胶质瘤病人生存期在一年以内。早在1925年,Wilder通过对脑胶质瘤组织银染色观察,第一次详细地描述了胶质瘤组织中小胶质细胞的存在。脑胶质瘤被证明具有免疫原性,但奇怪的是在肿瘤发生发展过程中并未发现机体对肿瘤产生明显的免疫反应。对手术切除的脑胶质瘤标本进行免疫组化的实验中发现,在脑胶质瘤组织中有大量的小胶质细胞及巨噬细胞集聚现象,同时还伴随少量的淋巴细胞浸润。对于脑胶质瘤组织中出现高水平的小胶质细胞浸润,目前倾向于认为是由于胶质瘤细胞在肿瘤的生长过程中向周围细胞微环境分泌释放趋化分子及生长因子等物质所致。研究表明,胶质瘤病灶中的小胶质细胞对胶质瘤细胞及细胞碎片几乎无吞噬现象出现。胶质瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞(GIMs)尽管仍能表达Toll样受体(TLR),且TLR及其配体的相互作用仍存在,但是不能引起GIMs激活而增强细胞身吞噬功能；另外,由于缺少必要的刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和CD40的表达,GIMs不能提供充足的刺激以激活T淋巴细胞。在对从老鼠分离培养的小胶质细胞的研究中发现,胶质瘤相关小胶质细胞在受到刺激信号后并不上调第二型主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)的表达,以至于小胶质细胞所表达的主要组织相容性复合体(MHC)不足以进行抗原呈递激活T淋巴细胞,而在无胶质瘤细胞的情况下小胶质细胞可明显的增强MHC-Ⅱ及B7的表达。胶质瘤细胞能够下调脂多糖(LPS)诱导的活化小胶质细胞分泌释放促炎症因子TNF-α能力。另外,胶质瘤细胞促使活化小胶质细胞分泌释放白介素-10(IL-10),后者抑制小胶质细胞由IFN-γ诱导的MHC分子表达引起抗原呈递功能下降,直接导致小胶质细胞难以激活T淋巴细胞。以上资料表明,由于受到胶质瘤细胞对小胶质细胞的吞噬、抗原呈递及分泌释放促炎症因子等功能的抑制,小胶质细胞在胶质瘤组织中不能启动针对癌细胞的、有效的固有性及适应性免疫反应。近期研究表明,小胶质细胞与胶质瘤微环境免疫抑制及促胶质瘤增殖、浸润有密切关系。金属蛋白酶(MMPs)所诱导的基质降解机制在胶质瘤侵袭和迁移过程中具有关键性的作用。MMP-2和MMP-9被认为与肿瘤的侵袭与迁移最为密切相关,而小胶质细胞和胶质瘤细胞本身均是MMPs的重要细胞来源。这些MMPs被分泌释放入肿瘤微环境,参与降解胶质瘤细胞外基质,并最终为胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移过程“铺路”。研究发现,胶质瘤能够引起小胶质细胞膜上MT1-MMP表达升高,而小胶质细胞MT1-MMP高表达又反过来促进胶质瘤所分泌释放的pro-MMP-2激活,大量活性MMP-2被分泌释放入胶质瘤微环境中,最终促进胶质瘤侵袭和迁移。因此,如果能够抑制小胶质细胞中促胶质瘤相关MMPs的表达,则有望降低胶质瘤侵袭和迁移的能力。阿托伐他汀是3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,直以来作为治疗心血管疾病药物被广泛应用于降低血液中胆固醇含量,但最近发现阿托伐他汀具有抗肿瘤作用。在内皮细胞及多种肿瘤中观察到他汀类药物对MMP-2、MMP-9和MT1-MMP的抑制作用。因此,我们选择阿托伐他汀作为干预因素探讨其是否能够影响胶质瘤细胞和小胶质细胞之间MMPs表达及其对胶质瘤侵袭和迁移影响。方法1、CCK-8法定量检测梯度浓度阿托伐他汀对原代人小胶质细胞和U87胶质瘤细胞活性影响。2、细胞迁移实验和肿瘤侵袭实验：通过胶质瘤条件培养基(GCM)孵化小胶质细胞,制备小胶质细胞条件培养基(MCM)。应用Transwell细胞迁移实验和肿瘤侵袭实验,检测MCM干预下U87侵袭和迁移能力,同时使用阿托伐他汀干预GCM孵化小胶质细胞制备MCM过程,检测U87侵袭和迁移能力改变。3、明胶酶谱法检测阿托伐他汀干预下U87胶质瘤细胞MMP-2和MMP-9表达,及阿托伐他汀与GCM联合干预下小胶质细胞MMP-2和MMP-9表达。4、Western Blotting检测阿托伐他汀干预下U87胶质瘤细胞MT1-MMP、 P-p38MAPK、P-ERK和P-JNK表达,及阿托伐他汀与GCM联合干预下小胶质细胞MT1-MMP、P-p38MAPK、P-ERK和P-JNK表达。5、QPCR检测阿托伐他汀干预下U87胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9和MT1-MMP相关基因表达,及阿托伐他汀与GCM联合干预下小胶质细胞MMP、MMP-9和MT1-MMP相关基因表达。结果1、10-4mol/L P可托伐他汀作用于细胞24h,U87胶质瘤细胞与和小胶质细胞细胞活力均明显降低,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。10-10mol/L阿托伐他汀显著增强小胶质细胞活力,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。10-～10-5mol/L各组U87胶质瘤细胞与小胶质细胞活力与对照组相比无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。根据结果,我们选择药物安全浓度内最大药物浓度10-5mol/L作为后续实验药物浓度。2、细胞迁移实验：10-5mol/L(?)可托伐他汀干预24h,每400倍镜下U87胶质瘤细胞迁移平均数为55.7±3.0,与对照组U87胶质瘤细胞迁移平均数63.7±3.3相比减少,差异有统计学意义(P<0.05)。MCM干预24h,U87胶质瘤细胞迁移平均数为89.44±3.5,与对照组相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.001)。阿托伐他汀MCM干预24h,U87胶质瘤细胞迁移平均数为56.3±3.2,与MCM干预组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.001)。肿瘤侵袭实验：MCM干预24h,每400倍镜下U87细胞侵袭平均数为28.2±2.8,与对照组U87细胞侵袭平均数13.2±1.9相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.001)。阿托伐他汀MCM干预24h,U87细胞侵袭平均数为11.3±1.0,与MCM干预组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.001)。10-5mol/L阿托伐他汀干预24h,U87细胞侵袭平均数为10.2±3.1,与对照组相比略微减少,差异有统计学意义(P<0.05)。3、将样品浓缩经明胶酶谱法检测U87细胞和小胶质细胞上清液中MMP-2和MMP-9表达。GCM干预24h,小胶质细胞上清液中MMP-2表达显著升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM联合干预24h,小胶质细胞上清液中MMP-2表达较GCM干预组显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。10-5mol/L阿托伐他汀干预24h,小胶质细胞上清液中MMP-2表达与对照组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。10-5mol/L阿托伐他汀干预24h,小胶质细胞上清液中MMP-9表达降低,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,U87细胞在阿托伐他汀中孵化24h, MMP-2表达降低。4、收集经10-5mol/L阿托伐他汀孵化的小胶质细胞和U87细胞,检测各组细胞中MT1-MMP、P-p38、P-JNK和P-ERK的蛋白表达。结果显示,GCM孵化小胶质细胞24h,小胶质细胞MT1-MMP表达与对照组相比显著升高。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化小胶质细胞24h,小胶质细胞MT1-MMP表达较GCM干预组显著降低。10-5mol/L阿托伐他汀干预U87细胞24h,U87细胞MT1-MMP表达与对照组相比轻微降低。小胶质细胞经GCM孵化12h和24h,P-p38表达均较对照组显著升高。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化小胶质细胞12h和24h,P-p38表达分别与GCM干预12h和24h相比显著降低,但P-JNK和P-ERK表达分别与GCM干预12h和24h相比无明显变化。U87细胞经10-5mol/L阿托伐他汀干预24h,U87细胞P-JNK表达较对照组降低,P-ERK和P-p38表达无明显差异。5、收集经10-5mol/L阿托伐他汀孵化24h的小胶质细胞和U87细胞,检测各组细胞中MMP-2、MMP-9和MT1-MMP相关基因表达。结果显示,小胶质细胞经GCM、10-5moI/L阿托伐他汀+GCM或10-5mol/L阿托伐他汀于预24h,MMP-2基因表达与对照组无明显变化(P>0.05),各组间均无明显差异(P>0.05),差异无统计学意义。小胶质细胞经GCM孵化24h, MT1-MMP基因表达较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。小胶质细胞经10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化24h,MT1-MMP基因表达与GCM干预组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。U87细胞经10-5mol/L阿托伐他汀孵化24h,U87细胞的MMP-2、MMP-9和MT1-MMP基因表达均较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.001)。结论本研究通过模拟胶质瘤与小胶质细胞间相互作用,证实了阿托伐他汀通过抑制小胶质细胞的促肿瘤作用降低胶质瘤的侵袭和迁移能力,并且这一作用可能是通过抑制小胶质细胞p38MAPK通道的表达,进而阻断下行MT1-MMP的上调实现的。另外,本研究还证明阿托伐他汀有一定的直接抗肿瘤侵袭和迁移作用,这种作用可能是通过抑制胶质瘤细胞MMP-2、MT1-MMP和P-JNK实现的。综上所述,这一研究发现为胶质瘤的治疗提供了新的思路,为阿托伐他汀能够作为胶质瘤辅助治疗的潜在药物提供了证据。