【摘 要】
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随着消费者对牛肉品质的要求越来越高,关于肉牛种质特性的挖掘利用越来越受到育种工作者的重视。中国草原红牛是我国育成的第一个肉乳兼用型品种,具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩、风味独特的优良特性;已发现一批影响草原红牛肉质特性,特别是肌内脂肪沉积的基因,但基因的具体功能仍需验证。MED4（mediator complex subunit 4,MED4）是介体复合物的亚基之一,位于12号染色体,同时也是一种
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随着消费者对牛肉品质的要求越来越高,关于肉牛种质特性的挖掘利用越来越受到育种工作者的重视。中国草原红牛是我国育成的第一个肉乳兼用型品种,具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩、风味独特的优良特性;已发现一批影响草原红牛肉质特性,特别是肌内脂肪沉积的基因,但基因的具体功能仍需验证。MED4（mediator complex subunit 4,MED4）是介体复合物的亚基之一,位于12号染色体,同时也是一种维生素D受体蛋白。可通过与维生素D受体结合,调节维生素D代谢,进一步影响矿物质离子稳态和骨骼完整性;有研究证明MED4基因在畜禽生长、胴体性状以及甘油三酯沉积中具有重要作用。有关MED4基因对牛前体脂肪细胞分化及其对脂代谢的影响研究较少。本研究以118头20月龄的草原红牛为研究对象,通过基因克隆获得草原红牛MED4基因的CDS序列,使用生信软件分析了该序列的理化性质和蛋白结构;利用q RT-PCR技术分析了MED4基因在草原红牛各组织中的表达差异;设计了外显子的特异性引物,通过PCR测序,筛查MED4基因的SNP位点,与嫩度、肉色、p H值、肌内脂肪含量、蛋白质含量以及眼肌面积等肉质性状进行关联分析。构建了草原红牛MED4基因的si RNA干扰和过表达载体,转染至草原红牛前体脂肪细胞。利用q RT-PCR和蛋白质免疫印记检测MED4基因m RNA和蛋白水平的表达情况;使用油红O染色和甘油三酯试剂盒,检测前体脂肪细胞中脂滴及甘油三酯含量,研究MED4基因对草原红牛前体脂肪细胞分化以及脂肪生成的影响。主要试验结果如下:（1）获得了草原红牛MED4基因的编码区序列。该序列全长813bp,编码270个氨基酸,蛋白质相对分子质量约为29707.34,理论等电点（p I）为5.06,属于可溶性蛋白,主要存在于细胞质和细胞核中（共占73.9%）。其二级结构主要由α-螺旋构成,蛋白质结构较为稳定。MED4基因在草原红牛不同组织中的表达水平差异显著（P＜0.05）,由高到低为肾脏、肺脏、脾脏、肝脏、皮下脂肪、十二指肠、心脏、背最长肌、睾丸、瘤胃。（2）发现草原红牛MED4基因第7外显子的两个SNP位点。在Chr12.17897166处存在A/G突变,导致氨基酸由甘氨酸（Gly）变为丝氨酸（Ser）;在Chr12.17897014处存在A/G突变,但未导致氨基酸改变,两个位点未处于HardyWeinberg平衡状态。与肉质性状关联分析结果显示,Chr12:17897166A＞G产生的不同基因型个体在肉质性状方面无显著差异;而Chr12:17897014A＞G产生的不同基因型个体,在肌肉蛋白质含量、嫩度、p H值及L值等方面差异显著（P＜0.05）。（3）MED4基因的m RNA在草原红牛前体脂肪细胞分化过程中的表达水平呈现升-降-升趋势。过表达和干扰试验表明,MED4基因的过表达组,在第0天和第4天上升最明显,成脂基因PPARγ的表达趋势与MED4一致;MED4基因干扰组,在第4天与第8天下降最明显,成脂基因PAARγ的表达仅在第8天下降最明显。油红O染色和甘油三酯含量测定表明,MED4基因的过表达,促进脂滴生成和甘油三酯累积;MED4基因的干扰,则抑制脂滴生成和甘油三酯累积。综上所述,本研究获得了草原红牛MED4基因的完整CDS区,对其理化性质和蛋白结构进行生信分析,阐明了草原红牛MED4基因在不同组织中的表达差异;发现MED4基因第七外显子存在两个SNP位点,能够影响草原红牛的肉质性状;明确了MED4基因在草原红牛前体脂肪细胞分化和脂肪生成过程中的促进作用。研究结果可为探究MED4基因功能以及草原红牛的肉质改良提供参考依据。
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