研究背景肝病是人类健康的一大威胁,多种因素直接或间接导致肝细胞损伤,诱发肝细胞内脂质过氧化物质过度累积,激活炎症细胞,分泌大量炎症因子。肝脏内过量炎症因子的持续刺激会促进肝星状细胞的活化,造成肝纤维化。由于疾病的复杂性,目前,临床上对肝纤维化的治疗效果较差。早期肝损伤阶段是各种肝病的共同病理基础,也是各种肝病发生发展的关键逆转时期。开发针对早期肝损伤阶段的保肝药物显得极为必要。芦笋,药食同源性的植物,具有低毒高效的特质,现代药理学研究发现芦笋制备的提取物具有较强的抗炎、抗氧化以及增强肝脏乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性等多种药理作用。探究瓯峰芦笋的保肝功效及相应的活性成分,为其成为防治肝损伤药物的开发品种提供实验基础。研究目的本文以瓯峰有机芦笋为研究对象,探讨新品种芦笋制备的提取物是否具有防治四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）所致的急性化学性肝损伤和急性酒精性肝损伤的作用及相应的药效部位,以期为该品种芦笋作为保肝天然药物的开发及保肝药物的添加剂提供实验基础。研究方法本课题主要分为以下四个部分:1.芦笋活性成分提取纯化及对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用研究将芦笋干品（去除顶端部分）以95%乙醇浸渍回流提取,所得95%乙醇提取物（95%ethanol extract,ETOH）用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取并冷冻干燥成相应部位萃取物[石油醚萃取物（petroleum ether extract,PE）、乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extract,EE）、正丁醇萃取物（butanol extract,BE）]。采用CCl4诱导的急性肝损伤模型,筛选保肝药效部位。以AB-8树脂对药效部位BE进一步分离,得到正丁醇部30%乙醇洗脱物（30%ethanol eluate of butanol extract,BEA）、50%乙醇洗脱物（50%ethanol eluate of butanol extract,BEB）、70%乙醇洗脱物（70%ethanol eluate of butanol extract,BEC）、90%乙醇洗脱物（90%ethanol eluate ofbutanol extract,BED）。再次以CCl4诱导的急性肝损伤模型,进一步筛选BE中保肝药效较佳部位。实验（1-1）将KM小鼠随机分成7组,分别为正常组、模型组、阳性药联苯双酯组以及芦笋95%乙醇提取物ETOH组及各部位组（PE,EE,BE）,预防性给药7天,除空白组外其余组通过腹腔注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型,24 h后处死小鼠,检测小鼠血清胆汁酸（total bile acid,TBA）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）以及天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）等指标的含量,同时检测肝组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量,观察肝组织的病理变化。实验（1-2）将KM小鼠随机分成8组,分别为正常组、模型组、阳性药联苯双酯组、BE给药组及芦笋正丁醇部4个梯度乙醇洗脱物组（BEA,BEB,BEC,BED）,预防性给药7天,除空白组外其余组通过CCl4建立小鼠急性肝损伤模型,24 h后处死小鼠,检测小鼠血清TBA,ALT,AST等指标的含量,同时检测肝组织中SOD,MDA的含量,观察肝组织的病理变化。2.芦笋各提取物对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用研究采用Gao-Binge模型法构建小鼠急性酒精性肝损伤模型,进一步对芦笋各提取物进行药效学验证,筛选芦笋中防治酒精性肝损伤的活性成分。实验（2）将C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药水飞蓟素组以及芦笋各不同部位组（ETOH,BE,BEA,BEB,BEC,BED）,通过Gao-Binge造模法建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,检测小鼠血清ALT和AST以及甘油三酯（triglyceride,TG）和胆固醇（total cholesterol,TC）的含量,观察肝组织的苏木精-伊红染色和油红染色结果。3.芦笋保肝药效部位的成分分析实验（3）按照中国药典2015版以及文献方法用紫外分光光度计对芦笋中黄酮类,多糖类（含糖物质）以及酚酸类物质进行定量检测。4.芦笋保肝药效最佳部位BEA组分的保肝机制研究实验（4）将KM小鼠随机分成6组,正常组,正常+高剂量BEA（200 mg/kg）组,模型组,CCl4+低剂量BEA（100 mg/kg）组,CCl4+高剂量BEA（200 mg/kg）以及CCl4+联苯双酯组（100 mg/kg）。除正常组和正常+高剂量BEA（200 mg/kg）组外,其余各组通过建立CCl4小鼠化学性急性肝损伤模型,24 h后处死小鼠,检测小鼠血清中ALT,AST,总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）以及白介素-6（interleukin-6,IL-6）的含量,同时检测肝组织中SOD,MDA的含量,观察肝组织的病理变化。免疫组化检测active Caspase-3的表达。Western blot检测肝脏组织蛋白Bax,CHOP,cleaved-Casepase-12以及NF-κB通路蛋白p-IKBα,NF-κBp65,p-NF-κBp65,MCP-1,IL-1β和i NOS的表达。实验结果1.芦笋活性成分提取纯化及对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用研究与模型组相比,芦笋ETOH组分及BE组分给药组小鼠血清中的ALT/AST/TBA的含量降低,肝组织MDA含量降低,SOD含量升高;苏木精-伊红染色结果显示芦笋ETOH组及BE组与模型组相比,肝组织炎症浸润减少,肝组织灶状坏死减少,且BE组效果优于ETOH组。进一步对药效部位BE组分进行分离,通过AB-8树脂进行梯度乙醇洗脱,并冷冻干燥得到相应的梯度乙醇洗脱物BEA/BEB/BEC/BED,再次以CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型进行药效学筛选,结果发现与模型组相比,BE组分及BEA组分干预后的CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT和AST以及TBA的含量降低,肝组织SOD的含量升高,肝组织MDA的含量降低。HE病理结果显示芦笋BE组及BEA组与模型组相比,肝脏灶状坏死减少,且BEA组分效果优于BE组分。2.芦笋各提取物对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用研究肝脏苏木精—伊红染色与油红染色结果显示芦笋ETOH组分和BE组分以及BEA组分干预组与模型组相比,脂肪空泡减少,脂滴数量减少;血清学指标结果显示与模型组相比,芦笋ETOH组分,BE组分和BEA组分干预组的急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT,AST,TG,TC的含量均降低,且以BEA组分效果最优。3.紫外成分分析结果为进一步探讨ETOH组分和BE组分以及BEA组分发挥药效的物质基础以及药效活性差异的原因,采用紫外分光光度计法检测组分中多糖（含糖物质）,黄酮以及酚酸类物质的含量。结果显示ETOH组分多糖（含糖物质）含量为26.80%?0.39%,酚酸含量为1.52%?0.22%,黄酮含量为4.21%?0.19%;BE组分多糖（含糖物质）、酚酸、黄酮含量分别为45.57%?1.16%,1.57%?0.27%,6.07%?0.24%;BEA多糖（含糖物质）含量为45.42%?1.96%,酚酸含量为7.19%?0.04%,黄酮含量为13.66%?0.33%;提示黄酮类及酚酸类物质的富集可能是BEA发挥疗效的主要原因之一。4.芦笋保肝药效最优部位BEA组分的保肝机制研究肝损伤指标ALT和AST的含量结果显示,与模型组相比,CCl4+低剂量BEA（100mg/kg）组和CCl4+高剂量BEA（200 mg/kg）组的血清ALT和AST的含量降低。肝脏病理学检查结果显示,BEA低、高剂量干预后的CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝组织炎症浸润减少,肝组织灶状坏死减少。BEA高剂量（200 mg/kg）摄入的正常小鼠在实验期间与蒸馏水摄入的正常小鼠相比,无统计学差异,提示200 mg/kg的BEA组分剂量为安全剂量。Western blot结果显示CCl4+低剂量BEA（100 mg/kg）组和CCl4+高剂量BEA（200 mg/kg）组与模型组相比,炎症因子MCP-1,IL-1β,i NOS和促凋亡蛋白Bax的表达降低,CHOP蛋白和cleaved-Caspase12表达降低。免疫组化检测结果显示模型组蛋白active Caspase-3表达升高,BEA低、高剂量组干预后,active Caspase-3蛋白表达降低。抗氧化酶检测结果显示模型组小鼠肝组织MDA的含量升高,肝组织SOD的含量降低,血清T-AOC的含量降低,BEA低、高剂量预处理后,各模型小鼠的血清指标均出现逆转。ELISA结果表明CCl4+低剂量BEA（100 mg/kg）组和CCl4+高剂量BEA（200mg/kg）组与模型组相比,血清TNF-α和IL-6的含量降低。TNF-a指标结果显示BEA高剂量（200 mg/kg）干预的效果优于BEA低剂量组。实验结论1.新品种瓯峰商业芦笋制备的提取物ETOH组分,BE组分以及BEA组分具有预防CCl4诱导的急性肝损伤以及防治Gao-Binge模型法制备的急性酒精性肝损伤的功效,BEA组分保肝功效最强。2.酚酸类物质、黄酮类物质以及多糖（含糖物质）的存在及富集可能是ETOH组分,BE组分及BEA组分发挥保肝功效以及功效存在差异的原因之一,酚酸类物质和黄酮类物质在BEA组分中富集可能是BEA组分药效最优的原因之一。3.BEA组分发挥预防CCl4诱导的急性肝损伤药效的作用机理可能与提高SOD,T-AOC的含量,减少MDA的蓄积,下调促凋亡蛋白Bax,下调cleaved-Caspase12和CHOP蛋白的表达,减少肝细胞凋亡,干预NF-κB信号通路减少炎症因子TNF-α,IL-6,MCP-1,i NOS和IL-1β的表达有关。