前言：在西方国家结直肠癌(Colorectal cancrt,CRC)导致的死亡排在癌症相关死因的第二位,在世界范围内每年有500,000人死于CRC,而且最近几年CRC的患病率有所增加。　　 据报道非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs),尤其是阿司匹林,可以抑制CRC的发生。虽然设计阿司匹林的初衷是解热镇痛、抗风湿、抗炎等,但是目前越来越多的流行病学研究以及体内外实验,支持阿司匹林防治CRC这一理论。然而,阿司匹林降低CRC风险的机制至今未明。大量研究证实,白细胞介素-6(interleulin-6,IL-6)和信号转导子及转录激活子3(signal transducer andactivator of transcription-3,STAT3)在结肠炎相关CRC小鼠模型中起到核心作用,且IL-6和STAT3都与核苷酸寡聚化区域2(nucleotide oligomerization domain2,NOD2/CARD15)基因多态性相关,另有研究表明在炎性肠病(inflammatory boweldisease,IBD)和炎症相关的胃肠道肿瘤中,IL-6/STAT3信号通路出现异常活化。IL-6可与其可溶性IL-6受体(soluble IL-6 receptor,Sil-6R)结合,之后IL-6/Sil-6R复合物与细胞膜上的gp130结合。一旦这种结合发生,gp130就会出现二聚化并启动细胞内的信号转导,例如诱导STAT3的活化。在CRC患者中,研究发现活化的STAT3水平明显增高;STAT3活化异常进一步诱导其下游的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达,这两个基因的过量表达则可以增加CRC细胞的增殖、存活、侵袭和淋巴结转移,并导致肿瘤组织向深层浸润,最终发生CRC患者预后不良。由于IL-6/STAT3信号通路在IBD和CRC中发挥重要的致病作用,因此针对这条通路的靶向治疗,可能为结肠炎相关CRC提供可靠且有效的治疗药物。　　 NOD2基因与微生物细胞壁原件的传感相关并调节炎症和凋亡。研究证实,NOD2是一种重要慢性炎症调节子,而NOD2的多态性与克罗恩病(Crohns disease,CD)易感性增加有关,CD是一种人类慢性IBD。众所周知,慢性炎症通过刺激细胞增殖和血管发生,以及通过诱导DNA损伤促进肿瘤的发生。患有CD的患者更容易罹患CRC。研究发现四个主要的NOD2单核苷酸多态性包括P268S,R702W,G908R,和3020insC与高加索人CRC发病率相关。已知NOD2与IL-6/STAT3信号通路关系密切,为了弄清NOD2多态性在CRC发生、发展中的确切作用,我们对已发表的研究做了一项meta分析。　　 尽管前面一系列的研究表明,阿司匹林可以预防CRC,阿司匹林治疗CRC的确切机制尚不完全明了。最近有研究发现,阿司匹林可以通过阻断IL-6/STAT3信号通路,在体外实验中诱导人类脑胶质瘤A172细胞凋亡。基于上述重要研究发现,我们设想阿司匹林对CRC的作用可能与其干扰IL-6/STAT3信号通路有关。本研究以致癌剂氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和致炎症试剂右旋糖酐硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导结肠炎相关CRC小鼠模型以及人CRC细胞HCT116为研究对象,观测阿司匹林对结肠炎相关CRC小鼠模型肿瘤形成、肠道炎症,模型鼠的结直肠CRC细胞和人CRC细胞HCT116凋亡的影响,以及检测阿司匹林治疗后IL-6/STAT3信号通路及其下游的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达变化情况,以期为阿司匹林防治CRC提供理论依据。　　 材料与方法：　　 一、文献检索、纳入标准及数据提取选择PubMed、EMBASE和SCI数据库进行检索,凡是涉及CRC和NOD2多态性关系的研究性英文文献均被检出并做进一步分析,纳入的文献为研究CRC和NOD2多态性关系的病例对照研究或队列研究,提取原文的原始数据进行meta分析。我们提取的原始数据主要包括:第一作者和发表年份;基因和相关多态性;研究设计特点和研究人群。　　 二、模型小鼠的制备及药物干预和HCT116细胞培养　　 1、结肠炎模型的建立,雄性Balb/c(6-7周龄)小鼠体重在17-22克,随机分成3个组:对照组,DSS诱导结肠炎组和DSS诱导结肠炎加阿司匹林治疗组。结肠炎相关CRC模型的建立,雄性Balb/c小鼠随机分成3组:对照组,AOM/DSS诱导结肠炎相关CRC组,AOM/DSS诱导CRC加阿司匹林治疗组。每组20只小鼠。依据Christoph Becker等人的研究方法诱导结肠炎相关CRC小鼠模型,即经腹腔一次性注射肿瘤诱变剂AOM(7.4mg/kg),接下来给小鼠饮用3％DSS(w/v)水持续一周,随后饮用正常饮水2周,如此循环3个周期。阿司匹林在实验起始以200mg/kg比例添加到饲料中。结肠炎模型造模过程同上,只改腹腔注射AOM为注射生理盐水。造模过程中监测小鼠体重变化及饲料的消耗情况。在实验第80天,用快速脱颈法处死小鼠,迅速收集全部的结直肠组织行大体标本拍照、解剖显微镜观察小鼠整个大肠的肿瘤数量和大小、组织块培养、浸泡福尔马林或-80℃冷冻处理等。　　 2、HCT116细胞用含10％FBS的McCoys5a改良培养基在37℃,95％湿度含5％CO2的培养箱中培养,取细胞呈单层贴壁对数增殖生长期使用。　　 三、组织病理学小鼠的结直肠组织经10％福尔马林溶液固定后制作成5微米厚的切片,并行苏木精伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色。肠炎情况根据Cooper等人的研究方法进行记录和评分。　　 四、CRC细胞凋亡　　 1、模型鼠CRC细胞凋亡指数(apoptotic index,AI)测定AI的检测根据Sinicrope等人的实验方法进行。　　 2、末端脱氧核糖核酸转移酶切口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling,TUNEL)检测CRC细胞的凋亡　　 (1)结肠炎相关CHC小鼠模型的结直肠组织制作成5微米的石蜡切片,经过去石蜡化和再水化过程,之后使用TUNEL试剂盒检测CRC细胞原位凋亡情况。　　 (2)通过TLINEL法对0mM,5mM,8mM浓度的阿司匹林干预48小时的培养HCT116细胞进行检测,观测体外培养人CRC细胞阿司匹林干预后凋亡情况。　　 3、流式细胞术测凋亡荧光素FITC标记Annexin V可以标记早期凋亡细胞,碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)可以检测出死细胞。通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测阿司匹林和IL-6作用前后体外培养的CRC细胞HCT116凋亡情况。　　 五、酶联免疫吸附实验分析对小鼠CRC组织块进行分离培养,24小时后收集上清液进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-6、Sil-6R。对IBD模型和结肠炎相关CRC模型的不同实验组小鼠的结直肠组织块进行匀浆处理,用特异性ELISA试剂盒对与炎症严重程度密切相关的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)进行检测,实验操作根据试剂盒的操作说明进行。　　 六、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析　　 1、小鼠的CRC组织经蛋白质样品制备、电泳、转膜、封闭等操作后,用兔抗小鼠STAT3,磷酸化STAT3(phosphorylation STAT3,P-STAT3),Bcl-2,Bcl-xl或β-actin抗体以1:500倍稀释孵育4℃过夜,再用TBST洗膜,后用过氧化物酶结合的二抗在常温下反应1小时,抗体在封闭缓冲液中稀释,其稀释比率为1:10000。ECL试剂与膜孵育反应,显像、扫描、拍照。　　 2、对体外培养的HCT116细胞进行蛋白提取,并对阿司匹林和IL-6干预前后的P-STAT3蛋白水平进行检测,方法同上。　　 七、荧光实时定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)为了检测不同实验组的IL-6,Bcl-2,Bcl-xl的表达情况,各组HCT116细胞依次经历了Trizol试剂盒提取总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA);逆转录合成Cdna;逆转录PCR反应;荧光定量PCR反应;扩增等实验步骤。Β-actin,IL-6,Bcl-2和Bcl-xl的引物如下:β-actin,5-GACGGCCAGGTCATCACTTTG-3和5-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3;IL-6,5-AGATTCCAAAGATGTAGCCG-3和5-TCTTTGCTGCTTTCACACAT-3;Bcl-2,5-GCGACGACTTCTCCCGC-3和5-GCGATGTTGTCCACCAGG-3;Bcl-xl,5-GTAGTGAATGAACTCTTCCG-3和5-GTATCCCAGCCGCCGTTCTC-3。　　 八、统计分析　　 1、CRC与NOD2多态性关系通过优势比(OR)和95％可信区间(CI)反映关联强度。用软件HWE评估在对照中Hardy-Weinberg平衡偏差。研究中的异质性用Cochrane Q检验来评估,当p＜0.05时考虑有统计学差异。通过计算机软件Review Manage,version5.0(Oxford,England,UK)来分析数据。　　 2、体内和体外实验中阿司匹林对CRC的作用采用SPSS13.0统计软件,所有参数均用means±SD表示,采用单因素方差分析或者Students t检验分析,p＜0.05考虑有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、CRC与NOD2多态性关系研究　　 1、NOD2 P286S多态性研究结果表明,携带变异基因型(-+·+/+)的人与携带纯合子野生型(-/-)的人在CRC发病率上没有显著性差异(OR1.27,95％CI0.32-5.00,p=0.73)。　　 2、NOD2 R702W多态性研究结果显示,携带变异基因型(-+·+/+)的人对比携带纯合子野生型(-/-)的人更易罹患CRC(OR1.59,95％CI1.09-2.32,p=0.02)。　　 3、NOD2 G908R多态性研究结果显示,携带变异基因型(-+·+/+)的人对比携带纯合子野生型(-/-)的人CRC发病率明显升高(OR1.98,95％CI1.14-3.44,p=0.01)。　　 4、NOD23020insC多态性携带变异基因型(-+.+/+)的人对比携带纯合子野生型(-/-)的人,CRC发病率明显升高(OR1.44,95％CI1.13.1.84,p=0.003)。　　 5、携带至少一种变异等位基因综合前述各项研究结果发现,携带至少一种高危等位基因的人更易罹患CRC(OR1.58,95％CI1.03-2.42,p=0.03)。　　 二、阿司匹林治疗对结肠炎相关CRC小鼠模型肠道炎症及肿瘤的影响　　 1、一般观察在结肠炎相关CRC体内研究过程中,对照组,AOM/DSS诱导结肠炎相关CRC组,AOM/DSS诱导CRC加阿司匹林治疗组小鼠在食物消耗量上没有统计学差异。AOM/DSS诱导结肠炎相关CRC组,AOM/DSS诱导CRC加阿司匹林治疗组小鼠体重较对照组出现下降,但AOMF/DSS组和AOM/DSS+阿司匹林治疗组间小鼠体重增长无明显差异。AOM/DSS诱导结肠炎相关CRC组,AOM/DSS诱导CRC加阿司匹林治疗组小鼠均出现结直肠肿瘤,尽管AOM/DSS诱导CRC加阿司匹林治疗组的肿瘤数量和大小较AOM/DSS诱导结肠炎相关CRC组均有所减少,但未达到统计学差异,我们的研究表明阿司匹林治疗不能预防结肠炎相关CRC的发生,且不能明显减少CRC肿瘤数量和肿瘤大小。　　 2、阿司匹林对肠炎的作用DSS诱导结肠炎组和DSS诱导加阿司匹林治疗组小鼠肠粘膜的炎症程度无明显差异,且促炎因子TNF-α和MPO的浓度在两组间无明显差异。AOM/DSS组小鼠和AOM/DSS+阿司匹林治疗组小鼠之间的肠炎严重程度也无明显差异,且TNF-α水平和MPO浓度在两组间也无明显差异。　　 3、阿司匹林治疗促进模型鼠CRC细胞凋亡组织病理学观察发现,AOM/DSS+阿司匹林治疗组样本的AI值要明显高于AOM/DSS单独诱导CRC组,p=0.01。TuNEL实验也证实,阿司匹林明显促进CRC细胞凋亡,p＜0.01。阿司匹林治疗能够明显的促进CRC细胞凋亡,但是阿司匹林治疗对非肿瘤区域的肠黏膜细胞凋亡并无明显影响。　　 三、阿司匹林通过抑制IL-6/STAT3信号通路促进结肠炎相关CRC小鼠肿瘤细胞的凋亡　　 1、阿司匹林减少IL-6表达ELISA检测结果提示,IL-6和SIL-6R水平不论是在AOM/DSS诱导CRC组还是在AOM/DSS+阿司匹林治疗组与对照组相比都显著提高。IL-6水平在AOM/DSS+阿匹林治疗组要明显低于AOM/DSS诱导CRC组,p＜0.01。SIL-6R的水平在AOM/DSS诱导小鼠CRC过程中显著提高,但SIL-6R的水平在AOM/DSS诱导CRC组和AOM/DSS+阿司匹林治疗组之间没有统计学差异,p=0.394。　　 2、阿司匹林减少P-STAT3的表达通过WB分析检测,我们的数据显示,STAT3的活化形式P-STAT3水平在AOM/DSS诱导CRC组和AOM/DSS+阿司匹林治疗组均显著提高,p＜0.01。此外,与AOM/DSS诱导CRC组相比,AOM/DSS+阿司匹林治疗组的P-STAT3水平明显降低,p＜0.01。　　 3、阿司匹林治疗抑制Bcl-2和Bcl-xl的表达通过WB分析检测,我们的数据表明,与对照组相比,Bcl-2和Bcl-xl的表达水平在AOM/DSS化学诱导CRC的小鼠中均显著增加,p＜0.01,这与P-STAT3蛋白表达变化一致,并且我们的研究发现,AOM/DSS+阿司匹林治疗组小鼠的Bcl-2和Bcl-xl的表达水平较AOM/DSS诱导CRC组小鼠显著降低,p＜0.01。　　 四、阿司匹林通过阻断IL-6/STAT3信号通路诱导人CRC细胞HCT116凋亡　　 1、TUNEL检测不同阿司匹林浓度干预时HCT116细胞的凋亡情况用TUNEL法检测0mM,5mM,8mM浓度的阿司匹林干预48小时的培养HCT116细胞的凋亡情况。我们的研究结果发现,当没有给予阿司匹林干预的时候,正常培养的HCT116细胞只有很少部分细胞发生自然的凋亡,而当分别给予5mM和8mM阿司匹林干预时HCT116细胞的凋亡显著增加,p＜0.01。　　 2、FCM检测不同阿司匹林浓度时HCT116细胞的凋亡情况选择0mM,5mM,8mM浓度的阿司匹林对HCT116细胞进行干预48小时后用FCM检测不同实验组细胞的凋亡情况。研究结果显示,当没有给予阿司匹林干预的时候,正常培养的HCT116细胞只有少量细胞发生自然的凋亡4.73％,而当分别给予5mM和8mM阿司匹林干预时HCT116细胞的凋亡增加分别为21.62％和32.27％,阿司匹林可以诱导HCT116细胞凋亡且8mM浓度时效果更明显。　　 3、RT-PCR检测不同阿司匹林浓度时IL-6的表达采用RT-PCR技术对不同浓度阿司匹林干预的HCT116细胞进行IL-6表达的检测。研究结果发现,阿司匹林干预后IL-6表达降低,且8mM浓度的阿司匹林作用效果最明显,p＜0.01。　　 4、阿司匹林减少P-STAT3的表达通过WB分析检测STAT3的活化形式P-STAT3的表达情况,研究发现P-STAT3的水平在阿司匹林干预后不论是5mM还是8mM均降低,且8mM浓度作用时效果更明显,p＜0.01。　　 5、阿司匹林治疗抑制Bcl-2和Bcl-xl的表达通过RT-PCR方法检测阿司匹林对STAT3下游的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达影响。数据显示阿司匹林治疗后,Bcl-2和Bcl-xl的表达水平均下降,且在8mM浓度阿司匹林时Bcl-2和Bcl-xl表达下降最明显,p＜0.01。通过体外实验,我们从基因水平上进一步证明阿司匹林可以下调Bcl-2和Bcl-xl表达。　　 6、添加外源性IL-6对细胞凋亡的影响研究发现,8mM浓度的阿司匹林干预48小时促进HCT116细胞凋亡(29.88％对比正常对照组5.31％),而当给予外源性IL-6(10ng/ml)和8mM浓度阿司匹林共培养细胞时,HCT116细胞的凋亡相应减少(从29.88％降低到12.18％),表明阿司匹林促进CRC细胞凋亡的作用能够被外源性IL-6拮抗,证明阿司匹林促进CRC细胞凋亡与其抑制IL-6/STAT3信号通路有关。　　 7、添加外源性IL-6对P-STAT3表达的影响研究发现,阿司匹林刺激后P-STAT3蛋白表达降低,而当给予外源性IL-6时,P-STAT3蛋白表达比较未加外源性IL-6组明显升高,表明予以外源性IL-6可以明显恢复其下游STAT3的活性,进一步证实阿司匹林促进CRC凋亡与其能够有效阻断IL-6/STAT3信号通路有关。　　 结论：　　 1、我们的meta分析结果表明,在不考虑年龄、性别和受试者症状的情况下,R702W、G908R和3020insC显著增加高加索人种罹患CRC的风险,而P268S对CRC的发病率没有影响。在其他人种中,NOD2基因多态性是否也与CRC的发病有关仍需进一步研究。　　 2、体内实验结果表明,在结肠炎相关CRC小鼠模型中,阿司匹林能够显著促进CRC细胞凋亡;阿司匹林治疗能够显著抑制结直肠异常活化的IL-6/STAT3信号通路、降低抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的表达;阿司匹林诱导CRC细胞凋亡可能与其能够抑制IL-6/STAT3信号通路、降低抗凋亡因子表达有关。　　 3、体外实验结果证实,阿司匹林能够促进人CRC细胞HCT116凋亡并有效抑制IL-6/STAT3信号通路。通过引入外源性IL-6对阿司匹林干预的HCT116细胞进行诱导,实验证实阿司匹林促进CRC细胞凋亡与其能够阻断IL-6/STAT3信号通路有关。