【摘 要】
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基因修饰猪技术进展迅速,但缺乏具有育种价值的功能基因和调控元件,成为限制因素。尤其是组织特异性调控元件,在家猪的研究中鲜见报道。本研究克隆了家猪脂肪组织特异性启动子元
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基因修饰猪技术进展迅速,但缺乏具有育种价值的功能基因和调控元件,成为限制因素。尤其是组织特异性调控元件,在家猪的研究中鲜见报道。本研究克隆了家猪脂肪组织特异性启动子元件,为下一步研究其功能打下基础。本研究首先利用在线软件Digital Differential Display (DDD)分析,获得100条家猪脂肪组织(背膘和腹脂)高丰度表达的ESTs,其中有45条是已知基因。然后对表达丰度最高的八条基因(LGALS12、ADIPOQ、FABP4、LPL、LIPE、CIDEC、SDR16C5和SMAF1)进行了Gene Ontolgy (GO)分析,七条基因(或其产物)是以细胞组件的形式存在,参与着脂肪细胞的分化和脂肪的合成代谢等过程,ADIPOQ没有任何与猪相关的功能注释。接下来利用实时荧光定量PCR技术对这8个基因的进行了组织表达谱分析,结果表明它们均在猪脂肪组织中高丰度表达,而且LGALS12、ADIPOQ和FABP4三个基因的表达具有脂肪组织特异性,由此推断它们的启动子也具有脂肪组织特异性。为了获得这三条基因上游调控区序列信息,本研究从猪的基因文库中筛选含有目的基因的阳性克隆,最终获得了含有LGALS12的阳性BAC克隆一个、含有ADIPOQ的阳性BAC克隆两个和含有FABP4序列的BAC两个;通过染色体步移测序,目前已获知了FABP4起始密码子上游10kb的序列,ADIPOQ起始密码子上游6.8kb的序列以及LGALS12起始密码子上游2kb的序列。再利用软件NNPP和PLACE分别对它们的核心启动子及顺式调控元件进行了预测,对预测结果进行分析,确定它们最有可能的核心启动子;同时有7种顺式调控元件大量存在于核心启动子区。最后利用PCR技术,分别扩增了FABP4基因起始密码子上游3kb和5kb的启动子片段以及三基因的核心启动子片段,并将ADIPOQ核心启动子序列克隆到带有红色荧光蛋白但无启动子元件的载体pDsRed-Express2-1中,为下一步鉴定启动子的脂肪组织特异性奠定了基础。
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