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天冬氨酸转氨酶可以催化芳香族氨基酸的合成和降解反应。 本论文对大肠杆菌中的天冬氨酸转氨酶进行分离纯化,并对其酶学、动力学 性质进行研究。 首先通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析、离子交换层析等方法对天冬氨酸转氨 酶进行分离纯化,比活提高84.164倍,得率为11.24%。同时通过SDS-PAGE电 泳测得其亚基分子量约为43000Da左右。 利用纯化后的天冬氨酸转氨酶进行酶学性质研究,确定该酶的最适反应温度 为50。C,最适pH为8.5。然后对其动力学性质进行研究,因为该转化反应属于 双底物、双产物转化反应,只能近似使用米氏方程,确定其表观米氏常数Km为 16.705mmolL-1,表观最大反应速度Vmax为0.46639mmol·L-1·min-1。转氨酶的转 氨反应机制都属于乒乓反应机制,因此采用乒乓反应机制对两步转氨反应进行研 究,得出第一步转氨反应的米氏常数为8.28mmol·L-1,第二步转氨反应的米氏常 数为14.677mmol·L-1 。由此可知在两步转氨反应中第二步转氨反应为限速反应。 即辅酶由胺型转为醛型为关键反应步骤。因此推断在反应初始阶段,纯酶液中添 加磷酸吡哆胺比添加磷酸吡哆醛能更快的促进产物的生成。由实验验证,反应 10分钟后,添加磷酸吡哆胺的AspAT比添加磷酸吡哆醛的AspAT产物生成率提 高了6.667%,120分钟后,提高率只有3.397%。 本文采用聚丙烯酰胺作为包埋材料,在细胞固定化中存在五种影响因素:凝 胶浓度、交联度、过硫酸铵浓度、TEMED浓度、含菌量。因此采取五因素,四 水平的正交实验,确定细胞固定化的最适条件。由正交实验确定大肠杆菌固定化 的最适条件为:凝胶浓度为15%、交联度为5%、过硫酸铵加入量为400 μ L、 TEMED加入量为60 μL、5%菌悬液加入量为2mL。同时测得固定化细胞表观 米氏常数为10.90109mmol·L-1,最大反应速度为0.06181 1mmol·min-1。对游离 细胞进行动力学常数测定,得出表观米氏常数为8.7848mmol·L-1,最大反应速 度为0.352mmol·min-1。将游离酶,游离细胞,固定化细胞的米氏常数和最大反 应速度进行比较,游离酶的最大反应速度高于游离细胞的最大反应速度:且游离 细胞的最大反应速度高于固定化细胞的最大反应速度。由于细胞的固定化,影响 传质效应,同时内扩散阻力会影响底物分子进入细胞进行反应,因此固定化细胞 4<WP=5>的米氏常数高于游离细胞的米氏常数。