叶酸是一种人体必需但又不能自主合成的B族维生素,缺乏叶酸会使植物或人体的某些生理活动受阻。叶酸缺乏症是现今全世界尤其是发展中国家面对的难题,通过膳食摄取每日所需的叶酸是更安全有效的方法之一。叶酸生物强化在土豆、番茄、水稻等作物上取得了积极进展,但是因为叶酸代谢途径的复杂性,不同植物的叶酸生物强化效果有差异。菠菜(Spinacia oleracea L.)是一种深受国内外人民喜爱的绿叶蔬菜,且叶酸含量很高,但是目前对菠菜叶酸的研究还很少。本文拟在菠菜种质资源叶酸含量评价的基础上,分析菠菜叶酸积累时空变化规律及环境因子响应规律,并通过对相关候选基因的生物信息学分析、表达量分析、基因克隆及遗传转化,筛选可能的菠菜叶酸积累关键基因,为遗传改良菠菜叶酸含量奠定基础。主要研究结果如下:1.通过同源序列比对,在菠菜基因组数据库中筛选得到25个与菠菜叶酸有关的基因,包括参与对氨基苯甲酸合成的ADCL、ADCS,参与蝶呤合成的GCHI、NUDT、DHNA,与叶酸组装加尾有关的DHFR、DHFS、HPPK/DHPS,参与叶酸聚谷氨酰化与胞内转运补救途径的FPGS、GGH、PTAR,还有与C1代谢相关的5FCL、5FCLL、DHC、FTHS、GCSH、GCSL、GCSP、GCST、MS、MTHFR、PURU、SHMT3、SHMT1a、SHMT1b。2.供试228份菠菜种质资源叶酸含量在10.18μg/g DW至311.5μg/g DW之间,平均含量为60.78μg/g DW。0.5 m M水杨酸、5 m M丝氨酸和5 m M苯丙氨酸溶液喷施处理的菠菜叶片叶酸含量显著性升高,分别比对照增加了1.5倍、1.1倍和1.2倍;100 m M氯化钠处理后的叶柄叶酸含量也比对照升高57.21μg/g DW。菠菜叶片叶酸含量在十二叶期达到顶峰,为151.90μg/g DW,在八叶期和十叶期的叶片叶酸含量最低(平均108.45μg/g DW);与叶片相比,叶柄叶酸含量变化较小(平均73.21μg/g DW),仅在十二叶期时含量最低,为62.39μg/g DW。3.苯丙氨酸处理诱导菠菜叶片NUDT、FTHS、MS、SHMT1a、SHMT3表达量升高;丝氨酸处理诱导菠菜叶片除ADCS、PTAR、DHFS、HPPK、5FCLL、FTHS、GCSH、PURU外的基因表达量升高;水杨酸处理使ADCL、NUDT、DHNA、GGH、DHC、MS、MTHR上调,氯化钠处理诱导ADCS、NUDT、DHNA、GGH、PTAR、HPPK、5FCL、DHC、FTHS、GCSP、GCSL、MS、PURU表达量上调。不同环境处理会影响菠菜叶酸相关基因表达量,但以上处理均显著诱导了NUDT、MS和DHC三个基因表达量上调。4.除MTHR外,大部分叶酸合成代谢基因在菠菜子叶期高表达;GCHI和MS主要在六叶期的叶片、叶柄中表达;GCSH在八叶期的叶片中表达量高;HPPK/DHPS、DHFS、PURU、DHC主要在十二叶期的叶片中表达;十叶期和十二叶期的叶柄中HPPK/DHPS表达量下调。DHFS、5FCL、GCSP、PURU表达水平与生育期叶酸含量的变化具有中等程度正相关,FTHS表达量与叶酸含量呈强程度正相关。5.转So DHNA、So DHFS、So GCHI、So NUDT、So PTAR拟南芥株系的地上部分叶酸含量分别比野生型拟南芥增加1.7倍、1.6倍、1.3倍、1.2倍和1.2倍。上述5个基因在菠菜叶片中瞬时单表达时,只有So PTAR使叶酸含量显著增加了2.5倍,为24.00μg/g FW,而So GCHI则使叶片叶酸含量显著下降了0.8倍,为13.52μg/g FW。当在菠菜叶片中瞬时共表达So PTAR与So DHNA时,菠菜叶酸含量增加了1.5倍,为20.22μg/g FW。