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肝细胞肝癌（HCC）作为主要的肝癌类型，其发病率在全球恶性肿瘤中排名第五位，特别是在亚洲和非洲发病率较高。肝癌也是中国最常见的恶性肿瘤之一。由于其复杂的病理机制与多源的发病原因，该疾病的临床治疗存在一些较为突出的问题，如早期诊断难、复发率高、缺乏特异性治疗和创新药物等。目前手术切除是最有效的治疗手段，但仅有20%的患者能够接受手术治疗。已有研究表明，许多肿瘤的形成和发展与体内某些抑癌因子的转录和蛋白表达有关。六亚甲基双乙酰胺诱导蛋白1（HEXIM1）是一种转录调节基因，能够与7SK snRNA复合体结合，抑制RNA聚合酶II活性。HEXIM1促进7SK snRNA与P-TEFb形成失活的7SK/HEXIM1/P-TEFb蛋白质与RNA复合物，阻止RNA聚合酶II磷酸化和随后的转录延伸，可控制约60-70%的mRNA合成。有据文献报道，HEXIM1对多种肿瘤（乳腺癌，肺癌）具有抑制作用，但是其抑制肿瘤的作用机制尚不清楚，目前还没有文献报道HEXIM1在HCC中的作用。本研究聚焦于HEXIM1在HCC发生发展中的作用，并初步探讨其作用机制。
目的：
研究HEXIM1在肝细胞癌发生发展中的作用及其可能的作用机制。
方法：
收集肝细胞癌患者的癌组织和其附近的正常组织样本（癌旁组织），通过实时定量聚合酶链式反应（qPCR）、免疫组化、免疫印迹的方法检测HEXIM1在肝细胞癌癌组织和癌旁组织中表达的情况；通过CRISPR/Cas9技术构建HEXIM1基因敲除的肝癌细胞株，同时通过瞬时转染的方法构建HEXIM1过表达的肝癌细胞。利用Transwell、细胞划痕法、细胞平板克隆实验、软琼脂克隆实验以及裸鼠成瘤实验来检测HEXIM1对肝癌肿瘤细胞侵袭、迁移、体外克隆形成能力以及裸鼠体内成瘤能力的影响；利用细胞计数、CCK8、MTT、qPCR以及细胞周期实验来评价HEXIM1对肝癌细胞系增殖能力的影响；利用TUNEL、流式细胞术实验来检测HEXIM1对肝癌细胞系凋亡的影响；利用RNA-Seq、ChIP、WB、qPCR实验来探讨HEXIM1对肝细胞癌发生发展机制的影响。
结果：
1.观察HEXIM1在HCC患者癌和癌旁组织中的表达情况
首先对按照标准收集来的HCC患者的组织样本提取RNA、蛋白和固定包埋。通过qPCR实验发现HCC癌组织HEXIM1的mRNA表达水平低于癌旁组织；通过免疫组化染色实验发现HCC患者癌组织中HEXIM1的蛋白表达低于癌旁组织；WB实验也发现同样的结果；通过生物信息学分析发现在HCC患者中HEXIM1蛋白表达相对高的患者术后的生存时间长于HEXIM1表达相对低的患者。以上结果提示，HEXIM1可能抑制HCC的发生和发展。
2.HEXIM1对肝癌细胞恶性生物学行为的影响
利用CRISPR/Cas9技术构建HEXIM1基因在HepG2细胞中敲除的稳定细胞株；通过瞬时转染的方法，在肝癌细胞中过表达HEXIM1。使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和瞬时转染的HEXIM1过表达的细胞，通过细胞计数实验、MTT、CCK8、qPCR以及细胞周期实验来检测HEXIM1对细胞增殖能力的影响。
结果显示HEXIM1敲除组细胞增殖能力比HepG2组细胞增殖能力强。同时，为了观察HEXIM1是否会影响细胞逆境环境下的增殖，在饥饿诱导48h后，用流式细胞术检测细胞周期，结果显示HEXIM1敲除组细胞在饥饿环境下增殖能力高于HepG2组，HEXIM1过表达组增殖能力低于对照组。以上实验结果表明，HEXIM1可以抑制肝癌细胞的增殖。利用细胞侵袭实验（Transwell）、细胞划痕实验来检测肝癌细胞的侵袭和迁移能力，结果显示HEXIM1敲除组细胞的侵袭和迁移能力增强，而HEXIM1过表达组细胞的侵袭和迁移能力降低；通过平板克隆实验和软琼脂克隆实验来检测HEXIM1对肝癌细胞系体外集落形成能力的影响，结果表明HEXIM1敲除组细胞体外集落形成能力增强。
3.HEXIM1对裸鼠体内肿瘤生长的影响
使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和HepG2细胞，通过裸鼠成瘤实验来观察HEXIM1对肝癌细胞裸鼠体内肿瘤生长的影响。
结果显示HEXIM1敲除组细胞在裸鼠皮下可以长出肿瘤，然而HepG2组细胞在裸鼠皮下没有形成肿瘤。以上结果表明，HEXIM1可以抑制肝癌细胞裸鼠体内肿瘤的生长。
4.HEXIM1对肝癌细胞凋亡的影响
使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和瞬时转染的HEXIM1过表达的细胞，利用TUNEL染色实验，流式细胞术实验来检测HEXIM1对细胞凋亡的影响，结果发现敲除组细胞凋亡明显低于HepG2组，而过表达组细胞凋亡比例明显高于对照组；同时还用饥饿去诱导凋亡，通过流式细胞术实验来检测HEXIM1对肝癌细胞在逆境环境饥饿条件下凋亡的影响，结果发现在饥饿条件下，HEXIM1敲除组细胞凋亡比例低于HepG2组，过表达组的细胞凋亡比例明显高于对照组。以上结果提示HEXIM1可以促进肝癌细胞的凋亡。
5.HEXIM1影响肝癌细胞对肝癌化疗药顺铂的敏感性
使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和瞬时转染的HEXIM1过表达的细胞，用顺铂（16μm/ml）处理24h，通过流式细胞术来检测细胞的凋亡，结果显示用顺铂处理24h后，HEXIM1敲除组的细胞凋亡比列明显低于HepG2组，而过表达组细胞凋亡比例明显高于对照组；用顺铂（10μm/ml）处理48h，通过细胞周期实验来检测细胞的增殖，结果显示HEXIM1敲除组细胞增殖速度高于HepG2组，而过表达组细胞增殖速度低于对照组。以上实验结果表明，HEXIM1可以促进肝癌细胞对肝癌化疗药顺铂的敏感性。
6.HEXIM1影响肝细胞癌发生和发展的机制
对已构建好的HEXIM1敲除的细胞和HepG2组细胞进行转录组高通量测序RNA-Seq，分析结果发现HEXIM1敲除的细胞中LIVIN的mRNA表达水平明显高于HepG2组。通过qPCR实验验证RNA-Seq结果，qPCR结果也显示HEXIM1敲除的细胞中LIVIN的mRNA表达水平明显高于HepG2组。用HEXIM1抗体进行ChIP实验，然后qPCR定量分析HEXIM1与LIVIN启动子结合情况，结果显示在HepG2细胞中，与IgG阴性对照组相比，HEXIM1抗体募集的LIVIN DNA更多。在HEXIM1敲除组细胞中LIVIN DNA与HEXIM1的结合明显低于HepG2细胞，因此HEXIM1可以与LIVIN的启动子结合。通过WB检测LIVIN信号通路蛋白（SMAC、XIAP、Caspase3、Cleaved Caspas3）的表达情况，结果显示HEXIM1可以上调促凋亡蛋白SMAC、Caspase3、Cleaved Caspas3的表达，下调抗凋亡蛋白XIAP的表达。以上结果显示HEXIM1通过抑制LIVIN的表达来抑制HCC发生和发展。
结论：
1.HEXIM1在HCC癌组织中表达低于癌旁组织。并且可以抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移、体外集落的形成和裸鼠体内肿瘤的生长。
2.HEXIM1可以增加肝癌细胞对肝癌化疗药顺铂的敏感性。
3.HEXIM1可以通过调节LIVIN的转录抑制LIVIN信号通路。
目的：
研究HEXIM1在肝细胞癌发生发展中的作用及其可能的作用机制。
方法：
收集肝细胞癌患者的癌组织和其附近的正常组织样本（癌旁组织），通过实时定量聚合酶链式反应（qPCR）、免疫组化、免疫印迹的方法检测HEXIM1在肝细胞癌癌组织和癌旁组织中表达的情况；通过CRISPR/Cas9技术构建HEXIM1基因敲除的肝癌细胞株，同时通过瞬时转染的方法构建HEXIM1过表达的肝癌细胞。利用Transwell、细胞划痕法、细胞平板克隆实验、软琼脂克隆实验以及裸鼠成瘤实验来检测HEXIM1对肝癌肿瘤细胞侵袭、迁移、体外克隆形成能力以及裸鼠体内成瘤能力的影响；利用细胞计数、CCK8、MTT、qPCR以及细胞周期实验来评价HEXIM1对肝癌细胞系增殖能力的影响；利用TUNEL、流式细胞术实验来检测HEXIM1对肝癌细胞系凋亡的影响；利用RNA-Seq、ChIP、WB、qPCR实验来探讨HEXIM1对肝细胞癌发生发展机制的影响。
结果：
1.观察HEXIM1在HCC患者癌和癌旁组织中的表达情况
首先对按照标准收集来的HCC患者的组织样本提取RNA、蛋白和固定包埋。通过qPCR实验发现HCC癌组织HEXIM1的mRNA表达水平低于癌旁组织；通过免疫组化染色实验发现HCC患者癌组织中HEXIM1的蛋白表达低于癌旁组织；WB实验也发现同样的结果；通过生物信息学分析发现在HCC患者中HEXIM1蛋白表达相对高的患者术后的生存时间长于HEXIM1表达相对低的患者。以上结果提示，HEXIM1可能抑制HCC的发生和发展。
2.HEXIM1对肝癌细胞恶性生物学行为的影响
利用CRISPR/Cas9技术构建HEXIM1基因在HepG2细胞中敲除的稳定细胞株；通过瞬时转染的方法，在肝癌细胞中过表达HEXIM1。使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和瞬时转染的HEXIM1过表达的细胞，通过细胞计数实验、MTT、CCK8、qPCR以及细胞周期实验来检测HEXIM1对细胞增殖能力的影响。
结果显示HEXIM1敲除组细胞增殖能力比HepG2组细胞增殖能力强。同时，为了观察HEXIM1是否会影响细胞逆境环境下的增殖，在饥饿诱导48h后，用流式细胞术检测细胞周期，结果显示HEXIM1敲除组细胞在饥饿环境下增殖能力高于HepG2组，HEXIM1过表达组增殖能力低于对照组。以上实验结果表明，HEXIM1可以抑制肝癌细胞的增殖。利用细胞侵袭实验（Transwell）、细胞划痕实验来检测肝癌细胞的侵袭和迁移能力，结果显示HEXIM1敲除组细胞的侵袭和迁移能力增强，而HEXIM1过表达组细胞的侵袭和迁移能力降低；通过平板克隆实验和软琼脂克隆实验来检测HEXIM1对肝癌细胞系体外集落形成能力的影响，结果表明HEXIM1敲除组细胞体外集落形成能力增强。
3.HEXIM1对裸鼠体内肿瘤生长的影响
使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和HepG2细胞，通过裸鼠成瘤实验来观察HEXIM1对肝癌细胞裸鼠体内肿瘤生长的影响。
结果显示HEXIM1敲除组细胞在裸鼠皮下可以长出肿瘤，然而HepG2组细胞在裸鼠皮下没有形成肿瘤。以上结果表明，HEXIM1可以抑制肝癌细胞裸鼠体内肿瘤的生长。
4.HEXIM1对肝癌细胞凋亡的影响
使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和瞬时转染的HEXIM1过表达的细胞，利用TUNEL染色实验，流式细胞术实验来检测HEXIM1对细胞凋亡的影响，结果发现敲除组细胞凋亡明显低于HepG2组，而过表达组细胞凋亡比例明显高于对照组；同时还用饥饿去诱导凋亡，通过流式细胞术实验来检测HEXIM1对肝癌细胞在逆境环境饥饿条件下凋亡的影响，结果发现在饥饿条件下，HEXIM1敲除组细胞凋亡比例低于HepG2组，过表达组的细胞凋亡比例明显高于对照组。以上结果提示HEXIM1可以促进肝癌细胞的凋亡。
5.HEXIM1影响肝癌细胞对肝癌化疗药顺铂的敏感性
使用已构建好的HEXIM1敲除的细胞和瞬时转染的HEXIM1过表达的细胞，用顺铂（16μm/ml）处理24h，通过流式细胞术来检测细胞的凋亡，结果显示用顺铂处理24h后，HEXIM1敲除组的细胞凋亡比列明显低于HepG2组，而过表达组细胞凋亡比例明显高于对照组；用顺铂（10μm/ml）处理48h，通过细胞周期实验来检测细胞的增殖，结果显示HEXIM1敲除组细胞增殖速度高于HepG2组，而过表达组细胞增殖速度低于对照组。以上实验结果表明，HEXIM1可以促进肝癌细胞对肝癌化疗药顺铂的敏感性。
6.HEXIM1影响肝细胞癌发生和发展的机制
对已构建好的HEXIM1敲除的细胞和HepG2组细胞进行转录组高通量测序RNA-Seq，分析结果发现HEXIM1敲除的细胞中LIVIN的mRNA表达水平明显高于HepG2组。通过qPCR实验验证RNA-Seq结果，qPCR结果也显示HEXIM1敲除的细胞中LIVIN的mRNA表达水平明显高于HepG2组。用HEXIM1抗体进行ChIP实验，然后qPCR定量分析HEXIM1与LIVIN启动子结合情况，结果显示在HepG2细胞中，与IgG阴性对照组相比，HEXIM1抗体募集的LIVIN DNA更多。在HEXIM1敲除组细胞中LIVIN DNA与HEXIM1的结合明显低于HepG2细胞，因此HEXIM1可以与LIVIN的启动子结合。通过WB检测LIVIN信号通路蛋白（SMAC、XIAP、Caspase3、Cleaved Caspas3）的表达情况，结果显示HEXIM1可以上调促凋亡蛋白SMAC、Caspase3、Cleaved Caspas3的表达，下调抗凋亡蛋白XIAP的表达。以上结果显示HEXIM1通过抑制LIVIN的表达来抑制HCC发生和发展。
结论：
1.HEXIM1在HCC癌组织中表达低于癌旁组织。并且可以抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移、体外集落的形成和裸鼠体内肿瘤的生长。
2.HEXIM1可以增加肝癌细胞对肝癌化疗药顺铂的敏感性。
3.HEXIM1可以通过调节LIVIN的转录抑制LIVIN信号通路。