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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）所致的猪急性腹泻性疾病,其临床表现主要可见初生仔猪的急性腹泻和呕吐、脱水和高死亡率。PED目前是一种危害我国养猪业的重要疾病,严重影响养猪业发展。当下PEDV变异毒株已成为我国流行毒株,且其流行已不可忽略,而由它所导致的疾病也将是在未来数年内危害仔猪最严重的腹泻疾病之一。经过近数十年来的努力,现已研发出灭活疫苗、基因工程疫苗、活疫苗等,但是现在市场上并没有针对PED的特效药。因此,充分了解该病近两年在江苏省的流行特点并且寻找一种新的治疗策略治疗PEDV感染具有重要的科学意义与应用价值。本研究针对PED在江苏部分地区的流行情况开展了流行病学调查并且对运用RNA干扰技术抑制PEDV的复制进行了初步研究,主要结果汇报如下:1.江苏地区2020-2021冬春季节猪流行性腹泻分子流行病学研究为了了解近两年PEDV在江苏的流行情况,2020-2021冬春季节,本研究在江苏省5个主要养殖地区（盐城、宿迁、常州、徐州和扬州）72个猪场采集777份小肠组织、粪便和肛拭子样本,用RT-PCR方法扩增PEDV-COE保守区进行PEDV检测。结果显示,共有57个猪场的449份样品呈阳性,猪场阳性率高达79.2%（57/72）,样品阳性率高达 57.8%（449/777）。其中盐城 78.1%（107/137）、宿迁 53.3%（218/409）、常州 48.2%（94/195）、徐州 80.0%（16/20）、扬州 87.5%（14/16）,说明江苏省 PED流行情况严重,需要引起重视。扩增不同地区代表性样品S1基因部分的核苷酸序列并测序,进行系统发育树分析,将该序列与GenBank中已有代表性毒株的相应序列进行比较发现,江苏省目前流行毒株具有遗传多样性,这对江苏省PED的防控工作有很大的挑战。根据S1基因的系统发育进化树,CH-SQJS-3、CH-YCJS-1、CH-SQJS-1和 CH-SQJS-2 均被归为 GII 组,剩余 3 株处于 GI 群（CH-YZJS-1、CH-CZJS-1、CH-XZJS-1）,与经典毒株CV777处于同一分支,但目前市面上DR13减毒和减毒CV777疫苗却只提供了针对GI组毒株的保护。采用细胞分离培养病毒技术,从上述阳性样品分离到一株新的PEDV毒株,命名为CH-SQJS-1。综上所述,本研究不仅为江苏PEDV的流行情况、分离株间亲缘关系提供了可靠的参考数据,还为针对江苏地区疫苗的使用提供了参考,同时分离到新的毒株为后续研究内容四提供了材料基础。2.amiRNA抑制PEDV在Vero细胞中的复制为了寻求新的PEDV治疗方法,本研究根据amiRNA设计原则,设计并化学合成2对分别靶向PEDV的N和S基因保守序列的amiRNA（amiRNA-349、amiRNA-1447）,经酶切鉴定以及测序分析确认其正确性,随后将其利用脂质体转染Vero细胞,并接种感染复数（MOI）为0.01的PEDV HN-13毒株,在转染细胞48h后,采用CCK-8检测amiRNA不同剂量转染组之间细胞活力的差异。在病毒感染24、48、72h（hourpost-infection,hpi）分别收集细胞和上清液,通过观察细胞病变效应（CPE）、TCID50、Real-time PCR 和 Western Blot 检测 amiRNA 抑制 PEDV 增殖的效果。结果显示,所构建的amiRNA可以有效抑制Vero细胞中PEDV的复制,CPE和CCK-8结果显示48hpi后amiRNA-349和amiRNA-1447转染组细胞病变远远降低,细胞存活率相对于病毒感染阳性对照组和amiRNA-NC阴性对照组增高。Real-time PCR、Western Blot、TCID50结果表明在这两种amiRNA中,amiRNA-1447对PEDV的抑制作用在48hpi 和 72hpi 远远强于 amiRNA-349,而 24hpi 时 amiRNA-1447 对 PEDV 的抑制作用较amiRNA-349来说是比较弱的。综上所述,本研究针对PEDVN和S基因最保守区域构建成功2种有效的amiRNA表达载体,为RNAi防治猪流行性腹泻奠定了基础,也为使用amiRNA干扰技术防治其他冠状病毒提供借鉴思路。3.amiRNA多靶点串联表达载体抑制PEDV在Vero细胞的复制为了解amiRNA对不同来源PEDV分离株的抑制作用,并发挥持久的抗病毒作用,同时为了避免病毒突变逃逸,本研究将上述两个单amiRNA序列串联构建了同时靶向PEDV N及S基因的amiRNA多靶点串联表达载体（amiRNA-349+1447）,使单个amiRNA能够同时表达。CCK-8结果显示amiRNA多靶点串联表达载体并无明显细胞毒性。TCID50结果显示在病毒感染24h、48h、72h转染amiRNA-349+1447组病毒滴度均显著低于amiRNA-NC组和病毒感染阳性对照组（VC）,其病毒滴度分别降低43.7、35.5、229.1倍。说明amiRNA多靶点串联表达载体可以有效阻止Vero细胞中病毒的复制。Real-time PCR和Western Blot结果显示串联后其抑制效果在不同时间段都显著增强。而转染amiRNA-NC组与病毒阳性对照组没有显著差别。综上所述,本研究成功构建了多靶点串联amiRNA表达载体,且其抑制效果总体上优于单靶点amiRNA表达载体,并在Vero细胞上证明了其对PEDV复制的抑制效果,从而说明多个amiRNA串联表达的方法可能会对病毒的选择性突变和变异带来的病毒逃逸具有抵抗力。4.amiRNA对PEDV江苏地区流行变异毒株CH-SQJS-1的抑制作用为了验证所构建的三种 amiRNA（amiRNA-349、amiRNA-1447、amiRNA-349+1447）对PEDV流行变异毒株的抑制效果。本研究将筛选得到的三种amiRNA作用于江苏地区流行变异毒株（PEDV CH-SQJS-1）,验证对江苏地区流行变异毒株的抑制效果,达到对临床上不同基因型PEDV引发的PED都有广泛治疗效果的目的。TCID50 结果显示在病毒感染 24h、48h、72h 转染 amiRNA-349、amiRNA-1447、amiRNA-349+1447组病毒滴度均显著低于amiRNA-NC组和病毒感染阳性对照组（VC）。Real-time PCR 和 Western Blot 结果显示 amiRNA 可以有效抑制 PEDV CH-SQJS-1毒株在Vero细胞内的转录与翻译。以上结果表明本实验构建的amiRNA可以有效阻止Vero细胞中PEDV江苏流行变异毒株的复制,为解决当前PEDV突变株多、不易控制的困境提供新的方向。