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肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae, KP)是自然界常在菌,属条件致病菌。它可引起急性人畜共患传染病,该病常发生于猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、貂、熊猫、等多种家畜、家禽及野生动物。同时也是造成无特定病原体动物(specific pathogen free animals, SPF)污染的主要微生物之一。对于实验大、小鼠,尤其是当机体免疫功能下降或处于应激状态时(不良环境、进行动物实验时),常因感染肺炎克雷伯杆菌而影响实验动物质量及干扰动物实验,甚至因大批动物死亡而造成损失,严重影响到教学及科研研究。国家标准(GB14926-2001)规定,肺炎克雷伯杆菌是SPF级实验大、小鼠必须检测并排除的病原体。常规检测需要采样、培养、染色、生化反应等多个实验步骤,要数天才能出结果,而且工作量大。为了能满足SPF级实验动物肺炎克雷伯杆菌快速、高通量检测的迫切要求,特进行本课题的研究。本研究结合微生物学、病理学等方法,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测小鼠肺炎克雷伯杆菌,通过试验的特异性、敏感性测定及临床样本的检测、验证,首次建立了快速、精确检测小鼠肺炎克雷伯杆菌基因的方法,为SPF级实验小鼠微生物质量控制,及肺炎克雷伯杆菌感染临床诊断提供一种新的有效工具。根据肺炎克雷伯杆菌phoE基因的序列,设计并合成一对特异性的引物,利用PCR技术扩增phoE基因片段,对KP和链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、巴氏杆菌(Pasteurella)等其他非KP菌株提取DNA进行PCR扩增。KP的PCR产物出现特异性DNA扩增片段,而其他非KP均未出现扩增片段,该PCR体系能检测出107pg KP-DNA,从提取DNA到PCR扩增及电泳结束仅需4h。用PCR对123份临床样品进行了检测,检出率为2.44%(3/123),与细菌学检查结果的符合率为99.19%。本研究采用生化试验结合PCR方法等从疑似KP感染的患鼠中分离出的一株细菌进行鉴定,确定为肺炎克雷伯杆菌KP(KPm0912)。用分离菌株KPm0912和标准菌株KP1300分别接种ICR小鼠,建立了KP感染的小鼠动物模型，从临床症状、大体病理变化、细菌学检查和组织病理学四个方面进行研究,探讨了KP的致病性。KPm0912对ICR小鼠的半数致死量(LD50)为1.1×105CFU/ml;KP1300对ICR小鼠的半数致死量(LD50)为1.3×106CFU/ml。感染鼠发生皮下脓肿；胸腔内出现胶冻样渗出,肺脏淤血,水肿；肝、脾等实质器官可见不同程度的肿胀,充血以及浆膜面出现脓性渗出物。在病理组织切片中,肺、肝、脾等组织中均可见大量炎性细胞浸润。以上试验结果表明,本研究建立的PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。该方法操作简单,便于疾病发生时的快速诊断和流行病学调查,适合SPF级实验大、小鼠肺炎克雷伯杆菌的监测。从组织病理学方面得到的影像数据,也为该病原体对小鼠的致病性研究提供了理论依据。