论文部分内容阅读
衰老是指生物个体的正常生理功能出现衰退的过程,可表现为皮肤皱褶、头发花白、行动迟缓、相关激素分泌失调、记忆功能减退以及多种组织器官的退行性变化等现象,衰老是老年病发生发展的重要危险因素。早衰伴随全身各种功能过早减退和老年病过早出现,脑衰老是机体衰退过程中最早、最重要的表现。脑衰老包括阿尔茨海默病、帕金森氏病等中枢神经系统退行性疾病,以认知功能障碍为前期主要表现,目前尚缺乏有效的治疗方法。目的:本研究通过系统梳理中医药关于衰老、早衰、脑衰老的理论文献,从气络学说精气神理论探讨早衰、脑衰老的病机治法,并重点阐述了气络气化作用和气化作用下温煦充养、信息传导、自稳调控功能与早衰、脑衰老之间的关系,揭示气络学说防治早衰、脑衰老的指导价值。实验部分通过建立D-gal诱导早衰小鼠模型,从整体功能状态、脑功能等不同层面探究八子补肾胶囊（Bazi Bushen capsule,BZBS）防治早衰、脑衰老的作用及机制。通过本课题为气络学说精气神理论指导早衰、脑衰老防治提供了理论和实验依据。方法:1.理论探讨:本研究理论部分系统梳理并总结了中医药关于衰老、早衰、脑衰老的病名、病因病机、治则治法、方药的认识;从气络学说精气神理论探讨早衰、脑衰老的防治,探讨气络气化作用及气化作用下温煦充养、信息传导、自稳调控功能异常与早衰、脑衰老的关系。2.实验研究:实验一:8周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后,根据体重将C57BL/6J小鼠按照完全随机法,分为正常组（100mg/kg/d无菌注射用水+0.5%CMC-Na）、模型组（衰老组,100mg/kg/d D-gal+0.5%CMC-Na）、NMN 对照组（NMN 组,100mg/kg/d D-gal+100mg/kg/d NMN）、八子补肾低剂量组（LD-BZ组,100mg/kg/d D-gal+1g/kg/d BZBS）和八子补肾高剂量组（HD-BZ组,100mg/kg/d D-gal+2g/kg/d BZBS）。第12周开始造模和治疗,每只小鼠按照0.1mL/10g体重的体积进行颈背部皮肤皮下注射（s.c.）造模,每只小鼠按照0.2 mL/10g体重的体积进行灌胃（i.g.）治疗,每日1次,连续给药60天。实验期间记录各组小鼠初始体重,每周在灌胃前称量并记录小鼠体重,每日观察动物精神状态、活动度、被毛状态,在造模和治疗结束后第1天拍照记录。采用悬挂、抓力、转棒、巴恩斯迷宫等行为学测试评价小鼠的肌肉力量、耐力、运动平衡能力和学习记忆力。运用无创血压测试、心脏超声检测评价小鼠血压和心功能。实验结束小鼠禁食12 h,麻醉后处死小鼠,收集血液标本用于检测小鼠血液中衰老相关分泌因子和抗炎因子的含量。打开小鼠腹腔和头骨,分别摘取胸腺、大脑、肾脏、脾脏、全心分别称重保存,用于后续苏木素-伊红染色（H＆E染色）、尼氏染色、衰老相关β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal染色）、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry Staining,IHC）、免疫组织荧光染色（Immunohistofluorescence Staining,IHF）、蛋白免疫印迹实验（Western Blot,WB）、实时荧光定量PCR检测（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）、多因子检测（Magnetic Luminex Assay）。实验二:通过H＆E染色、尼氏染色法检测各组小鼠脑组织神经元、尼氏体形态,运用WB、IHF法测定脑组织中突触后致密蛋白-95（PSD95）、离子钙结合衔接分子1（Iba1）蛋白表达,用qRT-PCR法检测脑组织中PSD95、Iba1、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）mRNA 以及小胶质细胞不同表型 CD11b、Arg-1、Trem-2、CD206、Fizzl、Ym1 mRNA,星形胶质细胞不同表型H2-D1、CD109、Ptx3、Sphk1、Tm4fs1 mRNA的表达,评价八子补肾胶囊（BZBS）对脑组织功能的作用;运用WB、IHC法检测脑组织中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A/p16INK4a（p16INK4a）、增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达,运用Magnetic Luminex Assay检测血液和脑组织中衰老相关分泌因子、抗炎因子、促炎症因子,包括 GM-CSF、IGFBP-3、Endoglin（CD105）、PAI-1、CCL3、CCL2、TNF-α、IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6、ICAM-1、MMP-3、MMP-9,CRP、IL-10的表达,用于评价细胞衰老是否参与D-gal致脑衰老的慢性炎症过程及评价BZBS对脑衰老中细胞衰老的作用。结果:1.理论研究:中医学认为人的最大寿限为120岁,衰与老不可等同,老年人可表现为健康状态（老而不衰）、欲病状态（渐老而衰）、疾病状态（衰老并见）。中年人可呈现未老先衰（衰先于老）的状态,即为早衰。脑衰老为机体衰退过程中最突出的表现之一,脑为元神之府,主宰生命活动、主司精神活动和感觉运动。中医学将早衰、脑衰老的病机责之以虚,精气神虚衰为主要原因,肾精亏虚为根本,历代方药以补肾精、培元气、滋肾阴、温肾阳分而论治。气络学说精气神理论认为精气神是健康长寿的内在因素,精是生命的起源、气是生命的动力、神是生命的体现,元精化生元气、元气化生元神、神能御形。气络为精气神气化处所,气络气化和气化作用下温煦充养、信息传导、自稳调控功能是精、气、神、形化生的重要保障,脑、髓之气络与脑、脊髓、神经功能密切相关。早衰、脑衰老的发生以肾精亏虚为根本,精不化气、元气虚衰、气不化神为主要病机,以形神失养、脑神失用为表现。确立了补肾填精、燮理阴阳、温扶元气、充养形神的治法,撷取历代中医药补肾理论精华创制的八子补肾胶囊具有补肾填精、充养形神的功效。2.实验研究:实验一:本部分实验结果证实,D-gal皮下注射诱导C57BL/6J早衰模型小鼠出现脱毛、毛色花白、活动度降低、认知功能障碍等早衰、脑衰老表现;BZBS能够改善D-gal诱导早衰小鼠的整体功能状态,包括被毛状态、体重、脏器指数、肌肉力量、耐力、灵活度、运动协调性、心功能、认知功能等方面。BZBS在多方面显示出提升早衰小鼠整体功能状态的作用。实验二:本部分实验结果证实,BZBS通过降低神经元损伤,减轻突触密度和可塑性下降,抑制小胶质细胞、星形胶质细胞活化,阻断、逆转小胶质细胞、星形胶质细胞由神经保护性表型向神经炎症性表型极化,降低神经炎症因子,提高抗神经炎症因子表达,进而改善衰老相关的认知功能障碍,发挥保护脑功能的作用。细胞衰老参与了 D-gal诱导脑衰老的慢性炎症状态的发生。BZBS可以减轻细胞衰老,降低促炎症因子表达,升高抗炎因子的表达。BZBS可能通过减轻脑组织中细胞衰老、促进细胞增殖、调节SASP,从而改善衰老相关的认知功能障碍。结论:1.理论研究:气络为精气神气化处所,脑、髓之气络与脑、脊髓、神经功能具有相似性,气络气化和气化作用下温煦充养、信息传导、自稳调控功能是精、气、神、形化生的重要保障。早衰、脑衰老以肾精亏虚、精不化气、元气虚衰、气不化神为病机,以形神失养、脑神失用为表现,其中气络气化和气化作用下温煦充养、信息传导、自稳调控功能异常导致精、气、神形气转化异常引发早衰、脑衰老。故治疗中确立补肾填精、燮理阴阳、温扶元气、充养形神的治法,兼顾气络气化,撷取历代补肾经验精华所创制的八子补肾胶囊具有补肾填精、充养形神的作用。2.实验研究:BZBS能够改善D-gal诱导早衰小鼠的整体功能状态下降;BZBS能够改善衰老所致的脑组织结构和功能的异常,其作用通过降低脑组织中细胞衰老、抑制衰老细胞SASP释放促炎症因子的表达,阻断、逆转神经保护性表型向神经炎症性表型极化,促进细胞增殖,进而保护神经元,提高突触密度和可塑性。