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脊髓损伤(SCI,spinal cord injury),常对患者神经系统的功能产生巨大的损害甚至导致瘫痪。SCI的治疗一直都是困扰医务工作者及社会的重大难题之一。CNS所处的内环境中阻碍神经轴突再生的因素对抑制CNS再生起到至关重要的作用,研究发现少突胶质细胞产生的Nogo蛋白对脊髓再生有抑制作用。如何抑制Nogo蛋白及其受体的作用已成为SCI基因治疗研究的热点。近年来兴起的RNA干扰技术在分子生物学领域的运用越来越广泛。该技术的机制在于将双链RNA(double-standedRNA,dsRNA)分子引入细胞,使其在mRNA水平上关闭相应序列的基因表达或使其沉默的过程,即序列特异性的转录后基因沉默(posttranscription gene silencing,PTGS)。这一基于核苷酸序列的基因沉默方法较以往的方法在可靠性、有效性、特异性方面都有较大的提高。目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对少突胶质细胞中表达nogo—66的抑制作用。通过体外实验了解所用siRNA能否特异性沉默nogo—66基因及其作用的时效性。方法:1、运用DNAman程序设计nogo—66基因PCR引物。在少突胶质细胞中扩增出nogo-66基因相应片段,建立扩增片段与T载体连接质粒,并测序。2、运用脂质体将GAPDH siRNA转染入少突胶质细胞,以Western-blot法检测干扰后GAPDH蛋白量,从而探索siRNA作用的有效浓度及有效作用时间。3、脂质体法转染设计的nogo-66 siRNA,运用荧光定量PCR(fluorescencequantitative PCR)、免疫荧光、Western-blot等方法检测干扰后nogo基因转录表达的变化,及不同时间点Nogo-A蛋白表达情况。结果:1、通过酶切及DNA测序方法鉴定所构建质粒序列正确。Nogo—66 PCR扩增片段能用于后续实验。2、通过转染GAPDH siRNA掌握siRNA作用有效浓度及相应作用起效时间。运用所掌握的方法转染nogo-66基因siRNA,提取转然后48h细胞总RNA,nogo-66PCR结果显示干扰成功。3、荧光定量PCR结果显示干扰后nogo-66 mRNA含量明显降低,其nogo-66mRNA量占未干扰细胞的0.24%(P＜0.001),而GAPDH含量无明显变化(P＞0.05)。免疫荧光显示干扰后细胞膜上Nogo-A明显减少。以上结果说明RNA干扰效果具有有效性及特异性。Western-blot检测显示干扰48h时Nogo-A量最低,干扰效果最佳,干扰120h时Nogo-A量恢复到接近无干扰水平。结论:nogo-66 mRNA序列特异性siRNA的引入能高效、特异的减少细胞中相应靶基因mRNA的量,从而降低细胞nogo-66的表达。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术有望成为脊髓损伤的有效治疗手段。