【摘 要】
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β防御素是一种多功能的阳离子肽,是先天免疫系统中关键组成部分,具有抗菌、抗病毒活性、抗肿瘤活性、促精子成熟等作用。本课题组发现山羊β防御素124（Goat beta-defensin 124,gBD124）可以通过p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达,但未发现与gBD124结合的蛋白;此外由于缺少β防御素单克隆抗体,下一步试验受限。因此本试验将gBD124基因进行克
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.31572407）；
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β防御素是一种多功能的阳离子肽,是先天免疫系统中关键组成部分,具有抗菌、抗病毒活性、抗肿瘤活性、促精子成熟等作用。本课题组发现山羊β防御素124（Goat beta-defensin 124,gBD124）可以通过p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达,但未发现与gBD124结合的蛋白;此外由于缺少β防御素单克隆抗体,下一步试验受限。因此本试验将gBD124基因进行克隆,在原核系统中表达并纯化,将纯化重组gBD124蛋白免疫小鼠,利用小鼠单克隆杂交瘤技术将脾细胞和骨髓瘤细胞融合筛选得到特异性单克隆抗体细胞株。利用制备的gBD124单克隆抗体进行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）试验,联合质谱筛选与gBD124蛋白相互作用蛋白,并将Co-IP与Western blot结合进行相互作用蛋白的鉴定。主要试验结果如下:（1）对山羊附睾gBD124基因进行载体构建,成功构建pET32a/gBD124载体,使用NiSmart Beads进行纯化,用重组牛肠激酶切除标签后获得纯化gBD124蛋白。将纯化gBD124蛋白免疫小鼠,细胞融合后获得5株能够稳定分泌gBD124单克隆抗体且效价高的单团细胞1B4、1C5、2E9、7E2和8C7,腹水制备的gBD124单克隆抗体1B4细胞株效价最高为1.12×10~5。（2）将制备得到的gBD124单克隆抗体固定在树脂上进行Co-IP试验,与质谱联用筛选与gBD124蛋白相互作用的蛋白,从山羊附睾头组织蛋白中筛选出3个互作蛋白分别为核纤层蛋白A/C（Lamin A/C,LMNA）、热休克蛋白90α（Heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1）和膜突蛋白（Moesin,MSN）。免疫荧光共定位结果显示gBD124和HSP90AA1共定位在细胞质中,gBD124和LMNA共定位在细胞核中;Co-IP与Western blot结果表明gBD124抗体固定的Co-IP复合物中有HSP90AA1蛋白无LMNA蛋白,说明HSP90AA1是gBD124相互作用蛋白。（3）通过荧光定量PCR和Western blot对山羊附睾组织中gBD124和HSP90AA1定量分析发现,gBD124在输出小管和附睾头1的表达量较高,显著高于附睾其他组织（P＜0.05）;HSP90AA1也在附睾头中的表达量较高（P＜0.05）。综上所述,本试验成功构建gBD124原核表达系统,获得gBD124纯化蛋白并制备gBD124单克隆抗体,筛选并鉴定发现了gBD124的互作蛋白HSP90AA1。
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