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目的:近年来放疗联合免疫治疗在清除肿瘤远端转移灶、延长患者的生存期方面展现出愈发光明的前景。然而,全身抗肿瘤免疫反应的激活也加剧了放疗引起的局部正常组织辐射损伤与炎症反应,这在一定程度上限制了放疗联合免疫治疗的广泛应用。如何突破正常组织辐射损伤对联合治疗的束缚,已然成为放射医学领域亟待解决的重要科学问题。本研究以免疫检查点程序性死亡受体-配体1（PD-L1）敲除小鼠为模型,深入探索电离辐射对PD-L1基因敲除型小鼠与野生型小鼠小肠上皮损伤的效应与机制,探讨焦亡执行蛋白GSDME在调控PD-L1敲除小鼠肠道辐射损伤中的作用,从而为理解放疗联合免疫检查点抑制引起的正常组织辐射损伤提供新思路,为减轻联合治疗的肠道副反应提供新策略。方法:采用肠上皮分离缓冲液分离小鼠小肠绒毛与隐窝,通过Western Blot技术检测PD-L1蛋白在肠绒毛与肠隐窝中的表达;对野生型小鼠进行全腹13 Gy的X射线进行照射,通过Western Blot技术检测照射后不同时间小肠隐窝中PD-L1蛋白的表达;Ki67免疫组化检测野生型小鼠与PD-L1基因敲除型小鼠肠隐窝的增殖;对野生型小鼠与PD-L1基因敲除型小鼠进行全腹13 Gy的X射线照射,观察小鼠的存活率;灌胃给予小鼠FITC荧光标记葡聚糖检测野生型小鼠与PD-L1基因敲除型小鼠照射前后肠道通透性;利用H＆E染色技术检测照射后小肠隐窝数目和绒毛长度;使用Masson染色方法检测受照射野生型小鼠与PD-L1基因敲除型小鼠肠道纤维化;利用肠隐窝类器官体外3D培养模型检测野生型小鼠与PD-L1基因敲除型小鼠肠隐窝的辐射敏感性;通过流式细胞术检测野生型与PD-L1敲除型小鼠全腹照射前后肠隐窝中CD8+T细胞比例;采用T细胞趋化抑制剂FTY720腹腔注射抑制PD-L1基因敲除型小鼠受照后的T细胞趋化,观察比较FTY720给药组与对照组小鼠肠道H＆E染色结果;通过Western Blot技术检测照射后不同时间肠隐窝内 GSDME蛋白介导的焦亡相关通路蛋白表达;应用腺相关病毒AAV-sh Gsdme-EGFP在PD-L1基因敲除型小鼠体内干扰Gsdme基因的表达,并对其转染效果进行检测,利用流式细胞术检测对照组与GSDME敲低组小肠隐窝中CD8+T细胞的比例,通过H＆E染色技术比较对照组与GSDME敲低组受照后小肠隐窝数目和绒毛长度。结果:（1）PD-L1蛋白在小肠隐窝中的表达量是肠绒毛中的2.5倍;隐窝PD-L1的表达在照射后逐渐增加,于照后第三天达到峰值,较对照组增加约5倍（p＜0.001）;Western Blot结果证实PD-L1蛋白的表达在PD-L1基因敲除型小鼠的肝、脾、肾、肺、小肠与大肠中都是缺失的;Ki67免疫组化结果表明野生型小鼠与PD-L1基因敲除型小鼠小肠的Ki67阳性隐窝数均为每毫米约22个,两种小鼠隐窝中的Ki67阳性细胞数均为22个,无统计学差异;小鼠全腹照射13 Gy,PD-L1基因敲除型小鼠的存活率为36.8%,显著低于野生型小鼠（存活率94.7%）（p＜0.001）;小鼠照射后灌胃FITC荧光标记的葡聚糖,PD-L1基因敲除型小鼠血清中的FITC荧光强度在照射后第3天、第7天都显著高于野生型小鼠（p＜0.01）,而未受照射的两种小鼠血清FITC荧光强度无差异,表明PD-L1基因敲除对于未受照射的小鼠肠道通透性没有明显影响,但显著加剧了照射后肠粘膜的破坏;H＆E染色结果也证实,在13 Gy全腹照射后7天,PD-L1基因敲除型小鼠的肠隐窝数目约为每毫米3.4个,肠上皮厚度约280 μm,均较野生型小鼠（每毫米约8.1个隐窝,肠上皮厚度约338μm）明显下降（p＜0.01）,表明PD-L1敲除显著加剧了小鼠的肠道辐射损伤;（2）对体外3D培养的隐窝类器官进行8 Gy照射,发现照射后第10天野生型小鼠类器官存活率为14.25%,PD-L1基因敲除型小鼠肠隐窝类器官的生存率为13%;流式细胞术结果表明PD-L1基因敲除型小鼠与野生型小鼠在照射前隐窝中CD8+T细胞的比例约为5%,二者无明显差异,而在照射后第3天PD-L1敲除小鼠肠隐窝内CD8+T细胞的比例（约23%）显著高于野生型小鼠（约12%）（p＜0.01）,当给予PD-L1基因敲除型小鼠T细胞趋化抑制剂FTY720后,照射后第三天小鼠隐窝中的CD8+T细胞下降至6%（p＜0.001）,同时,H＆E结果表明FTY720给药组较对照组显著缓解了受照射PD-L1基因敲除型小鼠的肠道辐射损伤,FTY720给药组的存活肠隐窝数目与肠上皮厚度较对照组明显增加,表明PD-L1基因敲除型小鼠的肠道辐射损伤与隐窝内CD8+T细胞的过量聚集密切相关;（3）Western Blot结果显示照射后第3天,隐窝中焦亡这一炎性死亡方式的执行蛋白GSDME被明显激活,其发挥细胞膜打孔作用的N末端（GSDME-NT）在照射后第3天明显增加,并且PD-L1基因敲除型小鼠GSDME-NT的表达是野生型小鼠的2倍,在照射后第5天,PD-L1基因敲除型小鼠隐窝中GSDME-NT的表达是WT小鼠的3.5倍。与此相对应的,在照射后3-5天,能够剪切GSDME蛋白进而形成GSDME-NT的两种蛋白cleaved Caspase-3和颗粒酶B（GzmB）均显著上调,PD-L1基因敲除型小鼠显著高于野生型小鼠,提示GSDME调控的细胞焦亡很可能在介导PD-L1敲除小鼠肠道辐射损伤中发挥了重要作用。采用腺相关病毒AAV-sh Gsdme-EGFP在PD-L1基因敲除型小鼠体内敲降GSDME的表达后,流式细胞术结果表明照射后第3天肠隐窝中CD8+T细胞的比例由22%下降至10%（p＜0.01）,H＆E染色结果也表明GSDME敲低显著缓解了 PD-L1敲除小鼠的肠上皮损伤（p＜0.01）,表明GSDME敲低能够明显减轻照射联合PD-L1敲除介导的肠道辐射损伤。结论:全腹照射后,PD-L1基因敲除显著加剧了小鼠肠道的辐射损伤,其机制与肠隐窝焦亡诱导的CD8+T细胞炎性浸润密切相关,GSDME在其中扮演关键性角色。