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H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)可引起鸡的呼吸道疾病和产蛋下降,在混合感染或继发感染其它病原的情况下有较高的发病率和死亡率,给我国养禽业造成严重的经济损失。H9亚型AIV的变异速度较快,但近年来我国分离的流行毒株大多属于Y280-1ike亚系。本研究将以马立克病毒(MDV) CVI988/Rispens疫苗毒株为载体,构建表达H9亚型AIV血凝素(HA)的重组病毒,并对其免疫效力进行初步评价,为H9亚型禽流感的防控提供新型疫苗。本研究以MDV CVI988/Rispens疫苗毒株的复制非必需片段sorf1-sorf2为插入位点,选择网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)作为启动子,构建了含H9亚型AIV Y280-like亚系毒株(A/Chicken/Anhui/1/2010) HA基因及EGFP标记基因的转移载体质粒(pMDV-HA/GFP)。以MDV CVI988/Rispens疫苗毒株的基因组DNA和pMDV-HA/GFP共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得带有EGFP标记基因的重组病毒rMDV-HA/GFP。然后用Cre酶去除rMDV-HA/GFP中的EGFP标记基因,得到仅有LTR启动子和HA基因的重组病毒rMDV-HA。经PCR和Western-blot试验鉴定,H9亚型AIV HA基因已正确插入到rMDV-HA基因组中,并且得到稳定表达。本研究评价了MDV-HA对H9亚型AIV Y280-like亚系毒株的免疫保护效果。将100羽1日龄SPF鸡随机分成5组,即rMDV-HA免疫组、rMDV-HA二次免疫组、rMDV-HA与H9亚型AIV灭活疫苗联合免疫组、H9亚型AIV灭活疫苗免疫组和CVI988/Rispens免疫组。前三组与CVI988/Rispens免疫组分别颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的相应疫苗；rMDV-HA二次免疫组于10日龄时加强免疫5000PFU的相应疫苗；联合免疫组和灭活疫苗组14日龄时分别肌肉注射0.25mL/羽H9亚型AIV灭活疫苗。于7、14、21、28、35日龄通过血凝抑制试验(HI)检测H9亚型AIV抗体效价。35日龄时,全部试验鸡用2×106EID50剂量的H9亚型AIV攻毒,于攻毒后第3天、5天采集喉头、泄殖腔棉拭子测定排毒规律。攻毒后第10天处死全部试验鸡,进行剖检和组织学检查。结果表明,在5个试验组中,rMDV-HA与H9亚型AIV灭活疫苗联合免疫组最早产生具有保护作用的抗体滴度,早于H9亚型AIV灭活疫苗免疫组约7天；该组喉头、泄殖腔的排毒率最低,而且剖检和组织学病理变化轻微。试验表明,rMDV-HA与H9亚型AIV灭活疫苗联合免疫所产生的应答更加全面和快速。本研究还评价了重组病毒rMDV-HA对MDV RBIB超强毒株攻击的免疫保护作用。将60羽1日龄SPF鸡随机分成三组：rMDV-HA免疫组、CVI988/Rispens免疫组和攻毒对照组,rMDV-HA免疫组和CVI988/Rispens免疫组的1日龄雏鸡分别颈部皮下接种5000PFU的相应疫苗。7日龄时,全部试验鸡腹腔接种500PFU的MDV超强毒株RB1B。观察6周,记录各组鸡的发病和死亡情况。经统计,攻毒对照组90%的鸡死于马立克氏病(MD),rMDV-HA免疫组和CVI988/Rispens免疫组对MD的保护率均为100%。试验表明,rMDV-HA可对MDV超强毒株的攻击能产生足够的保护力。