第一部分基于单细胞测序对大鼠角膜上皮细胞的分子印迹及细胞动力学分析目的:利用单细胞测序技术,分析大鼠角膜上皮细胞的分子印迹及细胞动力学。方法:用苏木素＆伊红染色观察大鼠角膜上皮结构,用克隆培养方法判断大鼠角膜上皮干细胞位置,用Krt12、Krt14、Krt15、Connexin 43及Ki67的免疫荧光染色来定位角膜上皮的结构以及角上皮细胞的增殖、分化过程。根据组织学结果,我们分别取角膜缘以及中央角膜的上皮细胞用10xGenomics系统进行单细胞测序（Singlecell RNA-Sequence,SCRNA-seq）测序和相关生物学分析。结果:在大鼠中,无论是角膜缘还是中央角膜,上皮细胞都可以分为表层扁平上皮细胞、中间翼状细胞以及基底细胞三层。通过免疫荧光染色,基底细胞层主要表达Krt14;中间翼状细胞层主要表达Krt12,而Krt14和Krt12在表层扁平角膜上皮鲜有表达;基于此,根据单细胞测序结果,把角膜缘以及中央角膜上皮细胞分别分为基底细胞层、中间细胞层以及表皮细胞层3群细胞,并分析其分子标记物及相关生物学功能。用角膜上皮克隆培养的方法,发现干细胞主要位于角膜缘;上皮干细胞的标记物Krt15也主要表达在角膜缘;Ki67主要表达在基底层细胞;Krt14主要表达在基底层的角膜缘干细胞和短暂增殖的细胞;Connexin 43的免疫荧光主要表达在短暂增殖的细胞;Krt12的主要为中间层终末分化的细胞;都为阴性表达的是表皮层终末分化细胞。我们把角膜缘及中央角膜上皮细胞的单细胞测序结果融合在一起进行分析,基于组织病理结果以及单细胞测序的拟时序分析,把角膜上皮细胞分为角膜缘干细胞、短暂增殖细胞、中间层终末分化细胞、表皮细胞层终末分化细胞以及色素上皮细胞等五群细胞;并分析其生物学特性。结论:通过角膜上皮细胞单细胞测序,可以了解角膜上皮细胞的分子印迹,深入了解角膜上皮的结构和功能;深化了角膜上皮的X,Y,Z理论,可以深入了解角膜上皮细胞在增殖分化过程当中的相关调控,以及各阶段角膜上皮的功能;通过角膜上皮单细胞测序,找到一系列角膜缘干细胞以及其他细胞群的标记物。第二部分不同炎症状态下角膜缘干细胞的命运研究目的:探究不同炎症状态下角膜缘干细胞命运。方法:我们建立了不同程度的角膜炎症模型,刮除中央角膜上皮、角膜中央缝线,以及联合中央角膜上皮刮除和角膜中央缝线3种炎症模型。用裂隙灯评估不同程度炎症模型中D1、D3、D5以及D7的炎症程度、新生血管以及角膜上皮的改变。在不同时间点,用苏木素＆伊红染色评估角膜上皮的形态、结构;为评估炎症程度,分别利用免疫染色检测中性粒细胞标记物PMN和巨噬细胞标记物CD68,以及利用RT-qPCR技术检测炎症因子IL-1β、TNF-α的表达情况。用TUNEL染色及Ki67的免疫荧光染色观察角膜上皮的凋亡及增殖情况。用Pax6、Krt12以及Krt10的免疫荧光以及RT-qPCR来观察角膜上皮的细胞表型。用克隆培养的方法来判断炎症对角膜上皮干细胞的影响。结果:在三种类型的炎症模型中,通过裂隙灯观察评估炎症指标、苏木素＆伊红染色、PMN及CD68免疫荧光染色以及IL-1β、TNF-α的RT-qPCR结果,根据炎症程度,初步把刮除中央角膜上皮认为是轻度炎症,角膜中央缝线为中度炎症,结合中央角膜上皮刮除和角膜中央缝线为重度炎症。在三种炎症模型中,角膜上皮细胞TUNEL阳性细胞没有明显的差别。三种炎症模型造模早期,Ki67阳性细胞均随着炎症加重而增加;在后期,在轻度炎症模型中Ki67表达恢复正常,中度炎症模型中持续增强,而重度炎症模型中却呈降低趋势。在细胞表型方面,重度炎症组的Pax6、Krt12表达紊乱或减弱,Krt10的表达增强;Pax6、Krt12及Krt10的表达在轻度炎症和中度炎症组相比正常组未见明显变化;中度炎症组Krt10的mRNA表达量高于正常和轻度炎症组,但明显低于重度炎症组。在角膜缘干细胞方面,正常组克隆形成率约为12.5%;轻度炎症的克隆形成率在第3天和第7天分别为和13.75%,没有统计学差异（统计结果为别为p=0.2242,t=1.436;p=0.1719,t=1.661）;中度炎症组在第3天克隆形成率为19.3%,在第7天时克隆形成率为18.25%,都明显高于正常组（统计结果分别为:p＜0.001,t=8.823;p＜0.0001,t=27.54）;在重度炎症中,在第3天克隆形成率为14.58,比正常组稍高（p＜0.05,t=3.597）,在第7天时克隆形成率为4.5%,比正常组明显减少（p＜0.001,t=11.29）;而且所有的克隆都可以分化为Pax6、Krt12阳性的细胞。结论:轻度炎症发生时,并没有引起角膜缘干细胞的明显变化;中度炎症可激活角膜缘干细胞,使干细胞的自我更新增强,数量增加,且有异常分化的倾向;重度炎症导致角膜缘干细胞耗竭,干细胞数量减少,干细胞功能的调控的紊乱,导致角膜上皮异常分化。第三部分重度炎症通过激活p38 MAPK信号通路导致角膜缘干细胞耗竭目的:研究重度炎症下角膜缘干细胞命运以及p38MAPK信号通路在该过程中的作用。方法:联合刮除中央角膜上皮以及角膜缝线的方法,构建重度炎症模型。部分造模组给予0.02%氟美童、巨噬细胞清除剂和p38信号通路抑制剂处理。在裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管、炎症情况和角膜上皮状态。在造模后3、7、14、28天收集眼球和角膜上皮组织,利用免疫荧光、免疫组织化学或/和RT-qPCR检测炎症标志物、细胞角蛋白标记物、干细胞标记物和信号通路相关分子表达情况。同时分离角膜上皮干细胞进行克隆培养,评估角膜缘干细胞的能力。结果:联合刮除中央角膜上皮以及角膜缝线的炎症模型可诱导大鼠角膜产生新生血管、基质炎症和弥漫性上皮缺损。角膜上皮中Krt12和Pax6的表达显著降低,Krt10和Sprr1b在大鼠角膜中表达上调。大鼠角膜克隆形成率（CFE）显著降低,角膜缘干细胞/祖细胞标记物Krt14、P63、ABCG2和Wnt7a表达也降低。造模后激活p38MAPK信号通路,可用0.02%氟美童、巨噬细胞清除剂和p38信号通路抑制剂进行逆转,处理后炎症减少,角膜上皮Krt12以及Pax6明显上升。在角膜上皮克隆培养中,p38信号通路抑制剂能促进Ki67、Krt14、P63、ABCG2和Wnt7a的表达,下调Krt12的表达。结论:炎症通过激活p38 MAPK信号通路诱导角膜缘干细胞异常分化。抑制p38MAPK的激活可促进角膜缘干细胞的自我更新,抑制异常分化。第四部分P38 MAPK信号通路抑制剂在组织工程角膜上皮构建中的应用目的:在构建组织工程角膜上皮中,需克服异常分化及上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）的出现。本研究拟在构建组织工程角膜上皮过程中应用p38抑制剂SB203580,探究p38抑制剂对组织工程角膜上皮干细胞干性维持及EMT的抑制作用。方法:在构建组织工程角膜上皮的过程中,加入p38抑制剂,观察细胞形态及生长情况的变化;用WB检测p38的表达及激活情况;用H＆E观察组织工程角膜上皮的形态结构;用免疫荧光和/或RT-qPCR检测细胞表型Pax6及Krt12的表达;用免疫荧光检测细胞连接Claudin-1、E-cadherin;用免疫荧光和/或RT-qPCR检测角膜上皮干细胞标记物Krt14、ABCG2、Wnt7a及P63的表达情况,同时用克隆培养的方法验证干细胞功能;用免疫荧光和/或RT-qPCR检测EMT标志物Snail及Wnt信号通路的下游表达因子TCF4的表达情况。最后将构建的组织工程角膜上皮应用于角膜缘干细胞缺乏的动物模型,观察上皮愈合情况,3周后取材观察角膜上皮的形态结构及表型。结果:在构建组织工程角膜上皮的过程中,加入p38抑制剂后能够明显抑制上皮细胞的EMT过程;加入p38抑制剂后能明显的抑制角膜上皮p38的磷酸化;加入p38抑制剂组能够分离出完整的角膜上皮片,细胞排列也更加紧密;加入p38抑制剂后对Pax6级Krt12的表达没有明显差别;加入p38抑制剂后,角膜上皮片的细胞链接Claudin-1、E-cadherin更加规律,量也更强;在加入p38抑制剂后,能明显的促进角膜上皮干细胞标记物Krt14、ABCG2、Wnt7a及P63的表达,相对的mRNA表达量显著增加,差异结果均有统计学意义;干细胞鉴定的金标准克隆培养中,加入p38抑制剂后,克隆形成率明显增加。与对照组相比,加入p38抑制剂后,能有效的抑制EMT标记物Snai1的表达,同时激活了 wnt信号通路下游的转录因子TCF4的表达。将构建的组织工程角膜上皮移植于角膜缘干细胞缺乏的动物模型中,与对照组及空白对照组相比,角膜上皮的愈合明显加快,并有正常的角膜上皮表型k12、pax6的表达。结论:P38抑制剂在构建组织工程角膜上皮过程中,能有效的抑制构建过程中上皮细胞的EMT出现,并能维持角膜上皮干细胞的干性;能更有效的用于治疗角膜缘上皮干细胞缺乏。