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沙门菌（Salmonella）是一种宿主范围广泛的常见食源性病原体,严重威胁到人畜健康,且给全球造成重大的经济损失。沙门菌感染所引起的疾病主要分为侵袭性伤寒沙门菌病和非伤寒沙门菌病两类:侵袭性伤寒沙门菌病主要由伤寒沙门菌（S.Typhi,Vi荚膜多糖）和甲型副伤寒沙门菌（S.Paratyphi A,SA,O抗原主血清型O2）引起,表现为肠热、菌血症和胃肠炎等症状;非伤寒沙门菌病的主要病原是鼠伤寒沙门菌（S.Typhimurium,ST,O抗原主血清型O4）和肠炎沙门菌（S.Enteritidis,SE,O抗原主血清型O9血清型）,通常造成局部性小肠结肠炎。近年来,沙门菌的耐药性越来越严重,多重耐药菌株不断涌现,使得疫苗接种成为预防沙门菌感染的首选。但目前还没有获得许可的疫苗可用于预防甲型副伤寒沙门菌的感染。此外,非伤寒沙门菌疫苗效果又局限于一组或一个血清型,针对其他种类的非伤寒沙门菌感染不能或只能提供部分交叉保护。因此,本研究拟构建能够共表达含有甲型副伤寒沙门菌O2、鼠伤寒沙门菌O4和肠炎沙门菌O9 O抗原的新型重组菌株,并通过动物感染模型评估其减毒株的免疫原性和交叉免疫保护效果,为疫苗的研制及应用提供理论依据和实验基础。本文研究内容主要分为两部分,研究方法及结果如下:1.基因组水平沙门菌分别共表达O2＆O4和O4＆O9 O抗原血清型新型重组减毒株的构建本部分通过基因重组技术成功筛选出两株重组株ST-ddhc::prt＿A1（O4＆O2）和SE-ddhc::abe＿B1（O9＆O4）,即这两株重组株分别可以实现共表达ST和SA的O抗原主血清型O4和O2、共表达SE和ST的O抗原主血清型O9和O4。两株重组株生物学特性结果表明O抗原的共表达不会对菌株产生显著影响,在此基础上分别缺失两株重组菌株的毒力基因cya和crp构建新型减毒株ST-ddhc::prt＿A1（O4＆O2）-?cya-?crp和SE-ddhc::abe＿B1（O9＆O4）-?cya-?crp。在动物感染模型中:两株新型减毒菌株均能诱导小鼠体内产生针对相应同源和异源O抗原结构的特异性Ig G抗体。ST-ddhc::prt＿A1（O4＆O2）-?cya-?crp可以有效保护小鼠抵御野生强毒株ST的侵袭。经SE-ddhc::abe＿B1（O4＆O2）-?cya-?crp免疫的小鼠能够抵御同源野生强毒株SE和异源野生强毒株ST的侵袭。本部分研究表明,重组减毒株SE-ddhc::abe＿B1（O9＆O4）-?cya-?crp可以用于预防ST和SE的混合感染。2.借助双重平衡致死系统及O抗原多糖表达质粒构建共表达沙门菌O2、O4和O9 O抗原血清型的新型沙门菌重组减毒株本部分首先利用自杀质粒同源重组和基因的无痕缺失技术构建ST的双重平衡致死系统,即BG突变菌株（S.Typhimurium?asd?dad B?alr?rec F?ca）,之后利用重叠PCR分别构建表达SA O抗原基因簇中tyv-prt＿A1-wzx＿A1-wbav＿A1基因的多糖质粒p15a-dad B-O9,然后将p SC101-asd、p15a-dad B质粒电转入BG感受态细胞中,得到重组株BG-01（O4）,将p SC101-asd-O2、p15a-dad B-O9质粒电转入BG感受态细胞中,得到重组株BG-01（O2＆O4＆O9）,同样将p SC101-asd-O2、p15a-dad B质粒和p SC101-asd、p15a-dad B-O9质粒分别电转入BG感受态细胞得到重组株BG-01（O2＆O4）和BG-01（O4＆O9）,其中BG-01（O4）、BG-01（O2＆O4）和BG-01（O4＆O9）均作为BG-01（O2＆O4＆O9）的对照组。银染和血清凝集实验结果均证明BG-01（O2＆O4＆O9）菌株可以成功共表达SA的主血清型O2、ST的主血清型O4和SE的主血清型O9 O抗原。随后,对重组株的生物学特性进行评估且证明p SC101-asd和p15a-dad B质粒的转入不会对菌株产生影响后,为进一步探究重组株BG-01（O2＆O4＆O9）的免疫效果,缺失BG-01（O2＆O4）、BG-01（O4＆O9）和BG-01（O2＆O4＆O9）菌株的毒力基因cya和crp构建了新型减毒株S.T-AS-01（O2＆O4）、S.T-AS-01（O4＆O9）和S.T-AS-01（O2＆O4＆O9）,然后通过体内实验检测各个减毒株在小鼠体内的定殖能力,同时也验证了各减毒菌株的安全性。最后,结合动物感染模型,评估S.T-AS-01（O2＆O4＆O9）减毒株的免疫原性和交叉免疫保护效果。ELISA结果显示:S.T-AS-01（O2＆O4＆O9）减毒株能够刺激小鼠机体产生anti-S.Paratyphi A LPS、anti-S.Typhimurium LPS、anti-S.Enteritidis LPS和anti-S.Typhimurium OMP的Ig G特异性抗体,同时也产生了针对相应O抗原结构的特异性Ig G2a和Ig G1抗体,且Ig G2a抗体水平普遍高于Ig G1抗体水平。免疫保护实验结果显示:经S.T-AS-01（O2＆O4＆O9）免疫后的小鼠都可以抵御100倍LD50的ST和SE野生强毒株的攻毒;此外,与其他所有组相比,当小鼠受到SA野生强毒株的腹腔攻击时,免疫S.T-AS-01（O2＆O4＆O9）组的小鼠存活时间最长。结果表明,改造后的ST减毒株S.T-AS-01（O2＆O4＆O9）能很好的建立针对异源和同源O抗原的特异性免疫反应。本研究探究了O2、O4和O9 O抗原共表达的可行性及对菌体本身的潜在影响,同时证明了共表达O2、O4和O9 O抗原的新型重组减毒株可以产生交叉保护反应从而预防ST和SE双重沙门菌的混合感染,为沙门菌多价疫苗的开发提供实验基础和理论依据。