【摘 要】
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四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine,TTMP）,又称川芎嗪,是一种具有生物活性的含氮杂环化合物,在医药、食品、化工等行业都有广泛的应用。四甲基吡嗪生物合成过程的中间产物复杂且难以检测,因而其生物代谢途径的解析仍面临诸多困难。本研究靶向筛选获得了高产四甲基吡嗪的菌株,并从其基因组和转录组信息中探究四甲基吡嗪及其前体物质乙偶姻的生物合成过程,为全面解析四甲基吡嗪生物合成途径提供了重要的
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四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine,TTMP）,又称川芎嗪,是一种具有生物活性的含氮杂环化合物,在医药、食品、化工等行业都有广泛的应用。四甲基吡嗪生物合成过程的中间产物复杂且难以检测,因而其生物代谢途径的解析仍面临诸多困难。本研究靶向筛选获得了高产四甲基吡嗪的菌株,并从其基因组和转录组信息中探究四甲基吡嗪及其前体物质乙偶姻的生物合成过程,为全面解析四甲基吡嗪生物合成途径提供了重要的理论数据。本课题首先从食醋发酵车间醋醅中筛选出48株可以生产乙偶姻的菌株,再通过高效液相色谱法复筛,发现其中共有20株菌可以生产四甲基吡嗪,继而对此20株菌进行发酵过程监测,选取四甲基吡嗪产量较高的菌株TYF-FGY-BD17（Bacillus subtilis）和TYF-FGY-BM12（Bacillus amyloliquefaciens）进行发酵条件优化,确定了两株菌的最适发酵条件,菌株TYF-FGY-BD17:蛋白胨30 g/L、蔗糖50 g/L、酵母粉15 g/L、磷酸氢二铵30 g/L,p H值维持原p H值（7.2）,温度37℃,转速200 r/min,四甲基吡嗪产量2.80 g/L;菌株TYF-FGY-BM12:蛋白胨30 g/L、蔗糖70 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸氢二铵30 g/L,p H值维持原p H值（7.2）,温度45℃,转速200 r/min,四甲基吡嗪产量2.68 g/L;基于发酵原料的经济性,选取菌株TYF-FGY-BD17进行后续研究,并对该菌株进行了全基因组测序,通过CAZy、COG、KEGG等数据库的分析,发现该菌株具有降解戊糖、己糖、二糖、多糖等各种碳源和外源蛋白的能力,结合数据库及文献,初步构建出菌株TYF-FGY-BD17乙偶姻的合成与代谢途径。为了进一步明确乙偶姻的生物合成过程及四甲基吡嗪生物合成关键基因,本研究对菌株TYF-FGY-BD17进行了转录组分析,确定了菌株TYF-FGY-BD17乙偶姻生物合成途径特征,其α-乙酰乳酸并非经过α-乙酰乳酸脱羧酶催化直接生成乙偶姻,而是先自然脱羧形成双乙酰,再被双乙酰还原酶还原为乙偶姻。此外,在乙偶姻生物合成过程中,操纵子acu ABC与aco ABCLR可能共同参与了乙偶姻的生物降解过程。依据四甲基吡嗪生成过程及相关基因转录水平的变化,寻找到15个与四甲基吡嗪合成相关基因,其中包括8个与蛋白质或多肽降解相关基因,4个与NH3产生相关基因,3个与转氨作用相关基因,这些基因在四甲基吡嗪快速合成阶段都具有较高的表达水平且呈协同作用趋势。为了验证菌株TYF-FGY-BD17的四甲基吡嗪生物合成途径中关键基因的作用,对经转录组数据筛选出的表达差异基因进行q PCR,得到了与转录组一致的结果。通过在线预测网站及转录单元分析预测,获得了11个与四甲基吡嗪生物合成相关的转录单元,并对各转录单元基因的功能进行了注释和分析,明确了其代谢通路,发现该菌株乙偶姻合成与缬氨酸、亮氨酸的生物合成具有关联,其乙偶姻生物合成途径具有显著特征。推测菌株TYF-FGY-BD17四甲基吡嗪生物合成途径如下:有机氮源在生物酶的作用下分解生成-NH4+,乙偶姻与-NH4+反应生成3-氨基-2-丁酮,或是在转氨酶的作用下将氨基酸上的氨基转移到乙偶姻上生成3-氨基-2-丁酮,随后3-氨基-2-丁酮经过缩合、氧化脱氢等步骤最终生成四甲基吡嗪。
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