山羊副流感病毒3型(Caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3)是单股负链RNA病毒,与HPIV3和BPIV3一样,都属于副粘病毒科(Paramyxoviridea),副粘病毒亚科(Paramyxovirinea),呼吸道病毒属(Respirvirus)。2013年,江苏和安徽部分羊场育肥山羊爆发了一种以呼吸道症状为主的传染病,从发病山羊样品中,首次分离到一株新的PIV3病毒,命名为CPIV3。由于目前没有高效、快速、特异的CPIV3抗体检测方法,为检测该病在羊群中的流行情况,急需建立一种血清学检测方法,为开展流行病学调查提供依据。本研究利用超离浓缩纯化的CPIV3病毒免疫6~8周龄雌性Balb/c小鼠,经过3次免疫和1次加强免疫后,取免疫小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过间接ELISA方法进行杂交瘤细胞的筛选,连续3次亚克隆后获得了2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2E6和4A4。两株单抗的细胞培养上清和腹水的效价分别为5.12×102和2.56×105,5.12×102和1.28×105,Western Blot和IFA实验证明两种单抗具有良好的特异性,能与CPIV3发生特异性反应。初步利用2E6和4A4单抗进行阻断ELISA检测,结果显示单抗2E6的阳性血清检出率为34/35,与此同时4A4检出率为19/35。表明单抗2E6在检测CPIV3抗体时具有特异性阻断作用,该单抗的制备为CPIV3阻断ELISA检测方法的建立提供了基础。通过方阵滴定法逐步优化CPIV3阻断ELISA的最佳反应条件,其最佳反应条件为以1:400倍稀释的纯化浓缩病毒(血凝价为213)为包被抗原;1:5倍稀释的待检血清样品作用时间45 min;1:900倍稀释的单抗2E6作用30min;1:4 000倍稀释的酶标二抗作用30 min;底物显色8 min。通过检测162份经中和试验验证CPIV3抗体的山羊血清,利用ROC曲线法进行特异性和敏感性分析,确定阻断ELISA反应的临界值为35.45%,在此临界值时,特异性和敏感性为98.8%,与病毒中和试验结果符合率为98%,高于血凝抑制试验与中和试验的符合率,其中检测中和抗体效价大于1:16的血清符合率为100%,用该阻断ELISA方法检测BDV阳性血清和PPRV阳性血清,结果均为阴性,以上结果证明该方法具有良好的特异性和敏感性。通过阻断ELISA方法重复检测8份血清,变异系数均小于10%,且均不影响结果的判定,证明该方法具有好的重复性。用本方法检测CPIV3攻毒试验的血清,结果呈现明显的规律性。以上试验证实,该阻断ELISA检测方法具有良好的特异性和敏感性,且与中和试验的符合率极高,有望替代中和试验检测血清样本中的CPIV3抗体,将在CPIV3的流行病学调查和疫苗免疫效果的检测中发挥重要作用。