奶牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种人畜共患传染病，一直困扰世界奶牛养殖业的发展，危害着人类和动物健康，给社会造成了巨大的经济损失。目前OIE指定的检测方法是结核菌素试验方法，但该方法受物理、化学以及生物因素影响，导致实验结果的特异性、敏感性不高；经典的细菌分离培养受到分枝杆菌生长缓慢的影响，检测周期耗时长；分子生物学检测技术近年来发展迅速，其灵敏性可靠性为结核病的检测提供了有力的支持，但是易污染及操作繁琐使之具有一定的局限性。另外关于结核病的确诊，仅仅依靠一两种检测手段仍不能确诊该病，因此建立快速、灵敏、特异的检测体系对于控制奶牛结核病迫在眉睫。本研究利用基因芯片技术对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌等开展了高通量检测技术方法研究，应用所建立的方法对临床样本进行检测，对广州周边奶牛场结核病流行情况做了初步调查分析。运用实时荧光定量PCR，对牛分枝杆菌进行了定量检测技术的研究。同时，还选取了牛布氏杆菌，对其做了尝试性研究。主要研究内容如下：　　 1、寡核苷酸探针的筛选　　 根据Genebank发布的M.tuberculosis、M.bovis、M.avium、M.paratuberculosis、Brucella序列，设计了多对引物，从中筛选出5对引物对其下游5’端进行荧光素Cy3标记，不对称比例扩增后与所设计的多条探针杂交，通过分析杂交信号值，筛选出5条特异探针，用于开展牛结核病基因芯片检测技术的研究。　　 2、奶牛结核病基因芯片检测方法的建立　　 将所筛选出的特异探针用生物芯片点样仪点至经醛基化处理的玻片上，与PCR扩增产物进行杂交反应，洗涤干燥后经扫描仪扫描获取杂交信号。通过探讨不对称引物比例、DNA聚合酶用量、镁离子浓度、退火温度、杂交温度、杂交时间等因素对芯片杂交的影响，确定了基因芯片体系的cutoff值。结果表明：M.tuberculosis，M.bovis，M.paratuberculosis，M. avium的荧光引物与非荧光引物最佳比率分别为1.0μM/0.1μM、1.0μM/0.125μM、1.0μM/0.1μM、2.0μM/0.2μM；最适DNA聚合酶的用量为1.0U；最适Mg2+浓度为3.0mM/L；最适PCR退火温度56℃；最佳杂交温度为42℃，最适杂交时间为60min。确定每条探针的cutoff值。当检测单一菌株时，检测的灵敏度可达到103copies/μL；应用建立的方法对临床采集样本检测，检出率为2.38％，对标准菌株模拟样本的检出率为100%。　　 3、实时荧光定量PCR检测技术的建立　　 针对牛结核病的主要致病菌牛分枝杆菌，选取其pncA基因，建立了SYBR GreenI Real-Time qPCR检测方法。通过对引物的优化确定25μL反应体系中引物浓度为15μmol/L，荧光定量PCR循环条件的优化结果表明，退火温度为60.5℃是最佳的扩增条件，以经10倍系列稀释(1.0×107～1.0×100 copies/μL)的标准质粒pMD18-MTB为模板，在1.0×101copies/μL仍有荧光曲线，表明该方法检测灵敏度可达1.0×101copies/μL，并确定其Ct值为30，当Ct值大于等于40或无扩增曲线为阴性，表示样品中无M.bovis；当Ct值小于等于30判为阳性，表示样品中含有M.bovis；当30＜Ct＜40，表示可疑，需要重新检测，若仍然在此范围且曲线有明显的指数增长期，可以判为阳性，否则判为阴性。　　 4、应用所建立的基因芯片检测技术、荧光定量PCR技术，以本实验室已建立的ELISA检测方法作为对照，对来自广州周边地区四个奶牛场336头黑白花奶牛共计552份样品进行了检测。结果显示，基因芯片法相对荧光定量PCR和ELISA检出率基本相符。三种方法检测阳性率分别为：2.98%、2.38%、3.32%，以其中两种方法出现阳性判为终阳性，得出总阳性率为2.08%。