血脑屏障(Blood–Brain Barrier,BBB)是血液与脑组织间的一种特殊屏障。由脑部的微血管内皮细胞、管周细胞、基膜、星型胶质细胞和部分神经元轴突末梢构成。在生理条件下,BBB为脑组织选择性通透营养物质,包括氧气、葡萄糖等。同时它可以保护脑组织不受血液中有毒物质的侵害,并将脑组织中的有害的成份过滤到血液中,维持了脑内环境的稳定,确保了中枢神经系统功能的正常执行。大量的研究表明,BBB通透性的改变和神经系统疾病密切相关。源于BBB的损伤和功能失调引起的神经系统的病变很多,其中包括脑缺血性疾病、脑肿瘤、神经退行性疾病(帕金森氏病,阿尔茨海默病)、癫痫、感染或炎症过程(脑膜炎、多发性硬化等)以及创伤等。一方面,在病理条件下,各种因素引起BBB通透性增高,血液中的大分子能够侵入脑组织,引起相应的病理反应。我们课题组以前成功建立了肾上腺素(AD)诱导的BBB开放的大鼠模型,证明了血液中的大分子如IgG可以漏出至脑实质,但这些大分子引起的脑内免疫反应知之甚少。另一方面,各种原因的脑损伤反过来也能够影响BBB的通透性,从而影响脑正常生理功能。但具体的病理改变及相应机制还不清楚。因此,研究BBB开放后的脑内免疫应答机制以及脑损伤对BBB的调控机制对于探讨BBB相关疾病的发病机理与防治策略具有重要意义。本研究分为两部分:一、小胶质细胞和星型胶质细胞对BBB开放后免疫应答机制研究通过我室成功建立的大鼠静脉注射AD诱导BBB开放模型,以小胶质细胞和星型胶质细胞这两种脑内最重要的免疫细胞为研究对象,采用PCR、Western blotting、免疫组化和免疫荧光双标等技术,观察Fcγ受体I(Fcγreceptor I,FcγRI)和Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)这两条重要的免疫应答通路在这两种细胞中的激活情况,探讨BBB开放后脑内免疫应答机制。结果发现,大鼠尾静脉注射AD可以瞬间显著提高动脉血压。免疫组化显示,血压升高、BBB开放后有大量的血中IgG分子漏出至脑实质中。对于FcγRI通路,PCR结果表明BBB开放后FcγRI mRNA水平显著提高,Western blotting结果表明FcγRI蛋白水平也显著提高。免疫荧光结果显示:升高的FcγRI定位于小胶质细胞和星型胶质细胞。定量PCR结果表明FcγRI通路下游的关键分子脾脏酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)和效应分子Interleukin(IL)-10、IL-4也都显著提高。而对于TLR4通路,虽然PCR、Western blotting和免疫荧光双标等结果显示TLR4水平在这两种胶质细胞也有一定提高,但增高的幅度较FcγRI分子增高幅度小。令人感兴趣的是,与FcγRI通路不同,定量PCR结果显示TLR4通路的下游关键分子髓样分化初级反应基因88(Myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)和效应分子IL-12a、IL-1β水平均显著降低。我们的结果表明,AD诱导的BBB开放后,激活了小胶质细胞和星型胶质细胞抑炎相关的FcγRI通路,提高了下游分子Syk的表达,进而导致抑炎分子IL-10、IL-4表达的上调。同时也发现促炎相关的TLR4通路中虽然TLR4分子水平升高,但通路下游关键分子MyD88及效应分子IL-12a, IL-1β被显著抑制,提示了促炎通路TLR4介导的促炎反应被抑制。这些结果提示小胶质细胞和星型胶质细胞有效的执行看家(housekeeping)功能,限制了BBB开放后炎症反应的过度激活,从而保护了神经系统免受炎症反应的进一步损伤。二、糖氧剥夺(oxygen and glucose deprivation, OGD)诱导的神经元损伤调控单层血管内皮细胞通透性机制的研究采用成熟的体外单层血管内皮细胞BBB模型,通过OGD处理神经元细胞后,与星型胶质细胞共培养,将培养后的星型胶质细胞再与单层血管内皮细胞共培养,通过荧光标记大分子检测单层内皮细胞BBB模型的通透性变化,用Western blotting方法检测紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5的表达状况。血管内皮生长因子(VEGF)是一个调节内皮细胞通透性的关键分子,我们采用ELISA方法检测了其在共培养细胞上清中的表达水平。进而,采用小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干预星型胶质细胞中VEGF的表达,观察其对上述实验模型中单层血管内皮通透性及相关分子变化的影响,以探讨OGD诱导的神经元损伤对单层血管内皮细胞通透性的调控及其中可能的机制。结果发现,与OGD处理的神经元共培养后的星型胶质细胞可以显著提高单层内皮细胞的通透性,然而与正常神经元共培养后的星型胶质细胞则对单层内皮细胞通透性则没有明显影响。进一步的Western blotting结果显示,在此过程中内皮细胞间的紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5在OGD处理的神经元组显著降低,提示这两种蛋白在OGD处理的神经元调控单层内皮细胞的通透性升高过程中发挥着重要作用。在此基础上,如果将星型胶质细胞去除,仅将OGD的神经元单独培养后的培养液与内皮细胞共培养,则不增加单层内皮细胞通透性,相应地,Occludin和Claudin-5蛋白也不发生明显变化,提示星型胶质细胞参与介导了OGD处理的神经元损伤诱导的BBB通透性增高。进一步的实验结果显示,OGD处理的神经元可以显著提高星型胶质细胞的VEGF表达;而通过RNA干扰技术阻断星型胶质细胞的VEGF表达,可以显著抑制OGD处理的神经元对单层内皮细胞通透性的影响,也相应地抑制了Occludin和Claudin-5蛋白表达量的改变。这些结果表明,OGD引起的神经元损伤可以诱导单层内皮细胞BBB模型通透性增高。这种神经元调控BBB通透性的作用需要由星型胶质细胞来介导完成。受损的神经元很可能是通过刺激星型胶质细胞高表达VEGF,而进一步降低内皮细胞紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5的表达水平而提高内皮细胞BBB的通透性。