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朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus是我国分布广泛,在棉花及多种蔬菜作物上为害严重而又难于防治的一种害螨。该螨繁殖力强,世代周期短,活动范围小,近亲交配率高,受药机会多,其抗药性问题甚至比其他农作物害虫更见突出。目前生产上使用的阿维菌素（abamectin）因其独特的作用机制和优良的防治效果已成为防治朱砂叶螨等害虫和害螨的主导药剂,但由于对其过分依赖和大面积单一使用,导致害虫、害螨种群抗药性的产生和发展。与一般的抗性生物学研究结果不同,害虫、害螨对阿维菌素产生抗药性后,并不总是表现适合度劣势,有些反而表现适合度优势,这将使害虫、害螨抗药性治理更加困难。前人的研究表明,阿维菌素抗性朱砂叶螨在高温下存在适合度优势。本文以朱砂叶螨的抗药性与耐热性及其相互关系入手,在生化和分子水平上研究了伴随朱砂叶螨对阿维菌素抗药性产生而产生的适合度升高的机理,这对于深刻理解生物响应环境胁迫的机制具有重要的生物学意义,同时对于更好地理解和利用抗性适合度来进行抗性治理也具有重要的实践意义。本项研究得到了国家自然科学基金（30600059）资助,通过3年的努力,获得了以下主要研究结果。1朱砂叶螨对阿维菌素抗药性和高温适应性及其交互耐性测定以朱砂叶螨敏感种群（SS）、阿维菌素抗性种群（RA）和耐高温种群（RH）为材料,应用生物测定及生命表研究方法,研究了朱砂叶螨对阿维菌素的抗药性和高温适应性及其相互关系。结果显示,46℃高温下种群50%的个体死亡的时间(Lt50):耐高温种群（RH）＞阿维菌素抗性种群（RA）＞螨敏感种群（SS）;阿维菌素对朱砂叶螨的毒力(Lc50):阿维菌素抗性种群（RA）＞耐高温种群（RH）＞螨敏感种群（SS）,表明长期的高温胁迫能诱导其对阿维菌素药剂的抗性,同样对阿维菌素产生抗药性后也能诱导其对高温的耐性。朱砂叶螨生命表研究表明,在高温（40℃）条件下,RA与RH的生殖力和存活率均高于SS,各种群参数（T除外）也优于SS,相对适合度（相对于SS）均有不同程度的升高,表明朱砂叶螨经长期的阿维菌素或高温胁迫后其适应高温的能力增强,在高温下朱砂叶螨抗性种群和耐高温种群适合度优于敏感种群。2抗阿维菌素朱砂叶螨的热激反应及热激蛋白研究选用朱砂叶螨敏感种群和阿维菌素抗性种群,测定了热预刺激后其在极限高温下的存活率,并应用SDS-PAGE技术研究了热激蛋白（HSPs）的种类及其含量。结果表明:非致死的热预刺激能显著提高朱砂叶螨耐极限温度的能力。两个种群在不同温度热激处理后,其蛋白质种类和含量发生了变化。正常情况下,朱砂叶螨敏感种群与阿维菌素抗性种群相比缺失8条蛋白条带;敏感种群热激后,增加了分子量分别为97.2、74.3、62.4、53.0和30.3 kDa的5条带;抗性种群热激后没有特异蛋白带的产生,但进一步高温胁迫后分子量为97.2,和74.3,62.4和53 kDa的蛋白表达增强。此结果有助于解释朱砂叶螨抗性品系存在高温适合度优势现象。3阿维菌素和温度胁迫对朱砂叶螨自由基及保护酶活性的影响以朱砂叶螨敏感种群（SS）、阿维菌素抗性种群（RA）和耐高温种群（RH）为材料,应用酶活力测定的方法,研究了阿维菌素和高（低）温处理后对朱砂叶螨体内自由基(O2?)、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性的影响。结果表明,朱砂叶螨经阿维菌素处理后,三种群体内的O2?含量急剧升高,药后4 h敏感种群、抗性种群和耐高温种群O2?含量分别是对照的3.54、3.42和2.91倍,同时SOD、CAT活性也明显高于对照:处理组中抗性种群体内O2?含量低于敏感种群,SOD、CAT活性高于敏感种群。高温和低温胁迫均能使朱砂叶螨体内的O2?、SOD、CAT、POD活力升高,敏感种群在42℃的热激下SOD、CAT、POD的活性达到最大,分别是对照的4.25、2.06、1.81倍,与其它温度处理差异显著（P＜0.05）,其后呈下降趋势,而抗性种群和耐高温种群保护酶活性在实验温度下,始终保持平稳上升的趋势;酶活性变化率分析结果显示,SOD对热胁迫的应激性最强,CAT次之,POD最小,抗性种群和耐高温种群3种酶活性的变化率均大于敏感种群。4朱砂叶螨TcHSP90基因克隆及原核表达采用RT-PCR及RACE技术克隆了朱砂叶螨热激蛋白TcHSP90基因（注册号为:EU851046）并进行序列分析,得到一条长2595 bp的完整cDNA序列,该序列ORF（Open reading frame,开放阅读框）为2169 bp,编码722个氨基酸,分子量约为83.45kDa,理论等电点为4.81,3’UTR（untranslated region,非编码区）为249 bp,5’UTR为177 bp。通过antheprot分析发现了5个HSP90家族的签名序列及胞质HSP90特征序列MEEVD。同源性分析表明,朱砂叶螨HSP90编码区核苷酸序列和其他已知的HSP90具有很高的相似性,尤其是与昆虫的HSP90核苷酸序列有极高的相似性。将鉴定正确的原核重组表达质粒pET43a-TcHSP90,转化E.coli BL21（origami）进行原核表达,应用SDS-PAGE和Western blotting技术分离并检测融合蛋白,结果表明构建的原核表达质粒可以在宿主菌中稳定、正确表达。朱砂叶螨TcHSP90基因的克隆、原核表达,为进一步研究HSP90的性质和功能的研究提供有用的实验材料。5朱砂叶螨TcHSP90基因表达的荧光实时定量PCR检测利用荧光实时定量PCR技术检测朱砂叶螨TcHSP90基因mRNA在高温、低温和阿维菌素刺激后相对于β-actin基因的表达情况。在正常情况下,阿维菌素抗性种群（RA）和耐高温种群（RH）TcHSP90 mRNA表达量均高于敏感种群（SS）,分别是SS的1.64倍和1.29倍。40℃高温诱导后SS、RA和RH处理组TcHSP90 mRNA表达量分别是各自的对照的1.83倍、2.98倍、2.58倍,差异显著（P＜0.05）;4℃低温诱导后SS、RA和RH处理组与对照组TcHSP90 mRNA表达量也达到显著水平（P＜0.05）,分别是对照的1.25、1.72和1.38倍。朱砂叶螨经阿维菌素处理后用荧光实时定量PCR检测TcHSP90 mRNA表达情况,SS、RA和RH经阿维菌素处理后8h,TcHSP90mRNA表达水平增加,SS、RA和HRH分别为对照（SS未处理）的1.38、2.36和2.06倍。以上研究表明,药剂阿维菌素和高、低温胁迫都能刺激朱砂叶螨TcHSP90表达增加,而在受到相同胁迫情况下,相对于敏感种群,TcHSP90在抗药性和耐高温品系中表达更为活跃。