【摘 要】
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目的通过建立CLEC3B稳定过表达细胞系,研究过表达CLEC3B后对肺腺癌细胞上皮-间充质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)及氧化应激的影响,同时探讨其影响细胞具体分子作用的机制。方法通过在线生信数据网(https://tnmplot.com/analysis/)分析CLEC3B在诸多癌症中表达水平。通过Kaplan-Meier Plotter数据库
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目的通过建立CLEC3B稳定过表达细胞系,研究过表达CLEC3B后对肺腺癌细胞上皮-间充质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)及氧化应激的影响,同时探讨其影响细胞具体分子作用的机制。方法通过在线生信数据网(https://tnmplot.com/analysis/)分析CLEC3B在诸多癌症中表达水平。通过Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)探究CLEC3B表达水平与患者5年生存率之间的关系。应用Western blot检测CLEC3B在A549、H1299和HBE细胞系的中基础表达水平。应用慢病毒构建稳定过表达CLEC3B(OV)及对照序列(NC)的A549细胞系且应用Western blot,和q RT-PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测CLEC3B过表达水平。应用CCK8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、克隆形成实验、Brd U(5-Bromo-2’-deoxyuridine,Brd U)染色、划痕实验、transwell实验检测CLEC3B对细胞增殖能力,侵袭和迁移能力的影响。应用ROS(Reactive Oxygen,ROS)荧光探针靶向结合细胞内的活性氧(ROS),并且应用荧光显微镜和流式细胞仪检测两组细胞自身活性氧水平。采用Mito-Tracker线粒体荧光探针结合活性线粒体,并通过荧光显微镜检测。运用ATP(adenosine 5’-triphosphate,ATP)检测试剂盒检测细胞内ATP水平。应用Western blot和q RT-PCR检测过表达CLEC3B后EMT相关基因在细胞内表达水平。应用Western blot检测MAPK信号通路、Stat3信号通路和AMPK信号通路磷酸化水平。结果1、CLEC3B在多肿瘤中表达情况及在肺癌中的预后分析CLEC3B在多种肿瘤中相比于正常组织表达较低(P<0.05)。CLEC3B在多组肺腺癌基因测序集中发现都呈低表达(P<0.05),且高表达CLEC3B,预示着有较好的预后水平(P<0.01)。2、CLEC3B在三组细胞系中的基础表达和稳转株鉴定CLEC3B在A549细胞系中表达最低(P<0.05),因此选择A549进行过表达病毒感染。稳转录CLEC3B慢病毒后,CLEC3B的蛋白和m RNA表达水平显著提升(P<0.01)。3、过表达CLEC3B显著抑制A549细胞增殖CLEC3B在A549细胞中过表达能显著抑制细胞的生长和增殖。在CCK8实验中,OV组的OD值显著低于NC组(P<0.05)。在Brd U实验中,与NC组相比,OV组的Brd U阳性率显著低于NC组(P<0.05)。OV组的克隆形成率也低于NC组,提示CLEC3B能显著抑制A549生长和增殖。4、过表达CLEC3B抑制A549细胞迁移和侵袭与对照组相比,过表达组显著抑制了A549的迁移和侵袭能力(P<0.05)。并且在过表达组中N-cadherin、α-sma、slug和β-catenin蛋白和m RNA表达水平显著降低(P<0.05),而E-cadherin水平则显著增加(P<0.05)。5、过表达CLEC3B影响了肺腺癌细胞的氧化应激水平与对照组相比,过表达组激活态ROS荧光探针显著降低,而非激活态ROS荧光探针显著增加(P<0.05)。此外过表达组中ATP水平和线粒体活性水平也得到了显著降低(P<0.05)。6、过表达CLEC3B抑制了MAPK、Stat3信号通路激活,且促进了AMPK信号通路激活与对照组相比,过表达组明显降低了p-MEK1/MEK1、p-ERK/ERK、p-Stat3/Stat3表达水平(P<0.05),增加了p-AMPK/AMPK表达水平(P<0.05),而p-p38/p38水平则没有统计学差异(P>0.05)。结论通过生信分析可知,CLEC3B在多种癌症中扮演抑癌基因的角色,且在肺腺癌中其表达水平和肿瘤进展有关,较高水平的CLEC3B预示着较好的预后生存水平。在细胞学实验中,过表达CLEC3B能显著抑制肺腺癌的增殖、迁移和侵袭能力,并能抑制EMT进展。在氧化代谢方面,过表达CLEC3B能增加细胞自身活性氧的产生,降低细胞内ATP水平,抑制线粒体活性。此外过表达CLEC3B能有效抑制MAPK通路和Stat3通路的激活,且能促进AMPK通路激活。
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