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目的：
构建EGF-IL—18融合基因的原核表达载体，分离纯化有活性的EGF-IL一18融合蛋白，为进一步研究其体外和动物体内的生物学作用奠定基础。
方法：
1.EGF-IL-18融合蛋白原核表达载体的构建和表达采用PCR方法，以质粒pFUS-EGF-IL一18为模板，扩增EGF-IL．18融合基因，并将其分别亚克隆入原核表达质粒pETl2a(+)、pET32a(+)，构建二种表达载体pETl2a(+)一EGF-IL一18、pET32a(+)一EGF-IL-18，限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。将二种表达质粒转化EcoliRosetta(DE3)，IPTG诱导其表达，SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。
2．表达上清中的EGF-IL-18融合蛋白的纯化以Ni-NTA亲和层析和阴离子交换柱层析DEAE-52二步法纯化表达上清中的EGF—IL一18融合蛋白。纯化产物经肠激酶酶切切除TrxA标签，进一步经Ni-NTA亲和层析纯化获得天然N端的EGF-IL一18融合蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析纯化产物。
3．EGF-IL-18融合蛋白包涵体的复性及纯化大量表达分离EGF-IL一18融合蛋白包涵体，并用2M尿素和1％TritonX-100反复洗涤。以8M尿素溶解包涵体，将包涵体裂解液上样于弱阴离子交换柱DEAE-52，进行柱上复柱，复性产物进一步用分子筛SephadexG-75纯化。复性纯化产物与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养24h，RT-PCR检测PBMCIFN-?mRNA的表达情况来评价复性效果。
4．体外实验检测EGF-IL-18融合蛋白的初步生物学活性将纯化的EGF-IL-18融合蛋白作用于人单核细胞性白血病细胞(KG一1)，ELISA法检测培养上清中IFN-?的分泌水平来初步评价EGF-IL-18融合蛋白生物学活性。
结果：
1.原核表达载体的构建和表达双酶切分析以及测序结果表明原核表达载体pETl2a(+)．EGF-IL．18、pET32a(+)一EGF-IL-18与设计相符；工程菌E.coliRosetta(DE3)/pETl2a(+)一EGF-IL-18诱导表达后在分子量为25kDa处可产生特异的表达条带，并能够被抗人IL一18单克隆抗体所识别。工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET32a(+)一EGF-IL一18诱导表达后在分子量为37kDa处可产生特异的表达条带，并能够被抗人IL—18单克隆抗体所识别，与预期一致。
2．表达上清中的EGF-IL-18融合蛋白的纯化EGF-IL一18融合蛋白经Ni-NTA亲和层析柱和阴离子交换层析柱DEAE-52二步法纯化后纯度达95％。肠激酶酶切EGF-IL一18融合蛋白可产生分子量为为16．7kDa和21kDa的两个蛋白，与预期一致。免疫印迹分析证实肠激酶酶切、纯化后的EGF-IL．18融合蛋白能够被抗人IL一18单克隆抗体所识别。
3．EGF-IL-18融合蛋白包涵体的复性及纯化变性的EGF-IL一18融合蛋白包涵体经阴离子交换层析柱DEAE-52柱上复性和分子筛SephadexG-75进一步纯化后纯度达95％。RT-PCR检测结果表明复性产物具有诱导人PBMCIFN-T基因表达的能力。
4．体外实验检测EGF-IL-18融合蛋白的初步生物学活性IFN-7ELISA结果显示，EGF-IL一18融合蛋白具有明显地诱导KG一1细胞产生IFN-7的能力，但活性低于标准MetIL一18。
结论：
我们成功构建原核表达载体pETl2a(+)一EGF-IL一18和pET32a(+)．EGF-IL-18，分离纯化获得了具有天然N端的、有活性的EGF-IL—18融合蛋白，同时建立了一套EGF-IL．18融合蛋白包涵体的复性和纯化方法，为进一步研究融合蛋白的体内外生物作用及其工业化生产奠定基础。