研究背景： 新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是缺氧缺血引起的胎儿和新生儿脑损伤性疾病，是新生儿常见的中枢神经系统疾病，病死率高，预后差，往往引起新生儿死亡、脑性瘫痪、癫痫以及智力低下，严重威胁儿童的身心健康，是造成儿童伤残的主要原因之一。积极防治HIBD对减少病死率及神经系统后遗症的发生具有重要的临床意义。而复制与人类HIBD相近的动物模型是上述研究的一个重要基础。本实验采用传统Rice法[1]制作新生大鼠HIBD模型，为新生儿HIBD的研究打下良好的基础。 对新生儿缺氧缺血性脑损伤，目前尚无确切有效的治疗方法，近几年对干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤进行了许多研究，本课题从临床应用出发，制作了缺氧缺血性脑损伤新生鼠模型；研究骨髓间充质干细胞及胚胎神经干细胞在体外的纯化、传代及分化，并应用非接触式共培养技术，探讨骨髓间充质干细胞及胚胎神经干细胞在不同环境下的分化、分泌情况及移植后对HIBD模型鼠的影响。 第一章：缺氧缺血性脑损伤动物模型的建立 目的：探讨建立HIBD动物模型的适宜方法。 方法：1.实验对象：健康SD(Sprague-dawley)大鼠及新生7日龄SD乳鼠，符合国家二级动物标准，由南方医科大学实验动物中心提供。2.缺氧缺血性脑损伤动物模型的制作采用经典Rice法：新生7日龄乳鼠结扎左颈总动脉加8％氧氮混合气吸入。并通过以下几个方面判断模型是否成功：在密闭缺氧舱中的表现，体重增长情况，脑组织病理形态改变及Y迷宫测试。 结果：乳鼠结扎颈总动脉后2h，进入密闭缺氧舱后不久即出现不同程度的缺氧症状：躁动不安、全身皮肤发绀、站立不稳，爬行时右后肢呈拖步，并逐渐出现全身肌肉颤动、不能翻身、自发或夹尾左旋、抽搐、甚至昏迷等表现。复氧后1h大部分表现为自发或夹尾向左侧旋转运动。体重增长及运动功能发育明显落后于对照组，病理改变可见脑组织出现大片坏死，细胞溶解、破坏；后期有神经胶质细胞增生，瘢痕形成。 结论：结扎新生鼠左颈总动脉加低浓度氧气吸入可成功复制HIBD的动物模型。 第二章：神经干细胞的分离培养及鉴定 目的：研究胚胎神经干细胞的分离、纯化、传代及分化规律。 方法：1.人NSCs的分离、培养及鉴定取12-24周胎龄水囊引产的新鲜人胚胎，无菌分离胚胎脑组织，制成单细胞悬液进行培养及冻存。采用有限稀释法进行克隆、传代，并用免疫细胞化学染色法对传代及分化细胞进行鉴定。2.鼠NSCs的分离、培养及鉴定取15～17d胎鼠，分离胎鼠海马及室周脑组织，制成单细胞悬液进行培养及冻存。采用有限稀释法进行克隆、传代，并用免疫细胞化学染色法对传代及分化细胞进行鉴定。 结果：分离培养的人及鼠胚胎神经干细胞呈圆球状，饱满，折光性强。3-5d时，即可形成由十到几十个细胞组成的细胞球。传代培养后，又可形成新的神经球。冻存细胞复苏后也能获得良好生长的神经球。海马、室管膜下区的神经干细胞数量较多，纹状体区的最少，用LSD进行两两比较，除鼠的纹状体区与皮质的比较无差异外，其它各部比较差异有显著性(P<0.05)。神经球能被BrdU标记，Nestin免疫化学染色呈阳性。神经球在含血清培养基的培养板上约2h就可见神经球贴壁，1d后神经球向外长出突起，细胞逐渐从神经球呈放射状向外周迁移，突起相互交错成网状。分化细胞呈MAP2、GFAP及GC染色阳性。 结论：人及鼠的胚胎脑组织中可分离培养出神经干细胞，能在体外培养条件下进行传代保持干细胞特性、也能向神经系统的终末细胞分化，但随着传代次数增加其活力有所下降。冻存的细胞复苏后仍具有上述特性。 第三章：骨髓间充质干细胞的分离、培养及纯化 目的：运用非接触式共培养技术探讨骨髓间充质干细胞在模拟体内环境下的分化情况及其对神经干细胞分化的影响。 方法：1.鼠MSCs的分离、培养、传代及诱导分化分离1月龄SD大鼠股骨和胫骨，冲洗骨髓腔细胞培养，采用贴壁筛选法与密度梯度离心法对MSCs进行纯化、传代，免疫细胞化学染色法对分化细胞进行鉴定。2.人MSCs的分离、纯化、传代及诱导分化取健康志愿者骨髓，密度梯度离心法分离单个核细胞培养。采用贴壁筛选法使MSCs进一步纯化、传代，免疫细胞化学染色法对分化细胞进行鉴定。 结果：冲洗出的大鼠全骨髓液培养后能得到骨髓间充质干细胞，其在倒置显微镜下见大多为球形、透亮、折光性强，单个分布，贴壁生长，通过换瓶的方式可使其纯化，经传代纯化后的的MSCs较原代细胞增殖快，细胞形态趋于一致，以梭形为主，胞体饱满，接近融合时呈薄纱状铺满瓶底。MSCs的胞体及部分突起Nestin染色呈阳性。传代后的MSCs细胞在含EGF、b-FGF，N2、B27的DMEM/F12培养基中进行诱导分化后，可见有神经元样、神经胶质样细胞出现，免疫细胞化学检测有呈MAP2、GFAP、GC染色阳性细胞。 结论：人及鼠的骨髓液中能培养出间充质干细胞，且能在体外进行纯化、扩增、传代，在一定的诱导条件下能横向分化为神经系统的细胞。 第四章：间充质干细胞与神经干细胞非接触式共培养 目的：初步探讨移植骨髓间充质干细胞对缺氧缺血性脑损伤模型动物的干预作用。 方法：MSCs与NSCs的非接触式共培养分别以人MSCs与人NSCs、鼠MSCs与人NSCs进行非接触式共培养，并分别加入神经干细胞培养基及间充质干细胞培养基。运用免疫细胞化学法检测共培养体系中MSCs和NSCs的分化情况。ELISA试剂盒检测共培养体系中生长因子的变化规律。 结果：1.人及鼠骨髓间充质干细胞，在神经干细胞及神经干细胞培养基诱导下，细胞形态发生变化、伸出细长突起，突起间互相连接，呈现出神经细胞样形态。2.人及鼠的骨髓间充质干细胞，在神经干细胞及间充质干细胞培养基的诱导下，细胞贴壁，但很少见到细胞出芽，也未出现如神经细胞样的突起。3.神经干细胞在骨髓间充质干细胞及神经干细胞培养基的诱导下，也可见到细胞出芽，向外周伸出突起，细胞增大变圆，呈现出神经细胞样形态，细胞突起间互相连接成网。4.神经干细胞在骨髓间充质干细胞及间充质干细胞培养基的诱导下也出现上述类似的神经样细胞形态，细胞伸出突起并相互连接成网状。5.上述神经样细胞在诱导培养14天后经免疫细胞荧光法鉴定呈Nestin、MAP2、GFAP及GC阳性。人NSCs与人MSCs、NSCs培养基的共培养体系中分化成的神经细胞比例最高，其次是人MSCs与人NSCs、NSCs培养基的共培养体系；人NSCs与鼠MSCs、NSCs培养基的共培养体系，鼠MSCs与人NSCs、NSCs培养基的共培养体系，他们相互之间比较，差异有显著性(P<0.05)，MSCs及NSCs在间充质干细胞培养基的共培养下诱导分化为神经细胞的比例明显降低，与其它各组比较，差异有显著性(P<0.05)。共培养体系中的上清行ELISA法检测，可见BDNF和NGF随着培养时间的延长而增加，第10、14d的NGF、BDNF的浓度较第7d高，各组间比较差异有显著性(P<0.05)。 结论：骨髓间充质干细胞在神经干细胞和神经干细胞培养基共同诱导下能分化为神经系终末细胞，产生BDNF和NGF。 第五章：骨髓间充质干细胞移植对HIBD模型鼠的治疗作用 目的：探讨MSCs移植对HIBD模型鼠的治疗作用。 方法：将用BrdU标记的MSCs移植入HIBD模型鼠脑室内，用免疫组化法检测MSC在模型鼠脑内的迁移及分化、脑组织的凋亡情况及Bcl-2与Bax表达的变化，并用改良神经功能损伤评分法及Y迷宫试验对HIBD模型鼠进行行为学检查。 结果：1.BrdU对MSCs的标记率能达93％以上，且MSCs的活细胞率约97.8％。2.注射入脑室内的MSCs能沿白质束迁移到皮质、纹状体、前脑和小脑等部位，迁移后失去MSCs在培养基中的典型特征，而分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经系统细胞。3.移植组的早期及晚期凋亡率下降，且移植组的Bcl-2的表达升高，而Bax的表达降低，与模型组比较差异有统计学意义。4.移植后HIBD模型鼠的mNSS评分及Y迷宫的学会次数较对照组下降，差异有统计学意义。 结论：MSC移植能显著改善HIBD模型鼠的病理及功能变化，移植MSCs治疗HIBD有确切的疗效。