应用16SrRNA技术研究寻常痤疮患者面部微生物群落及使用复方黄柏液治疗前后变化

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背景:  寻常痤疮是皮肤科临床常见的一种毛囊皮脂腺单位慢性炎症的损容性皮肤病,可在任何年龄发病,常见于青少年。寻常痤疮发病机制涉及多种内外因子对毛囊皮脂腺单位的综合作用,其中微生物与痤疮的相关性被广泛关注,但却存在很大争议,微生物是作为导致疾病发生的因素,还是加重疾病进程的因素,仍需要进一步研究论证。  目的:  通过测定寻常痤疮患者与健康人面部皮肤表面微生物群落的构成及其丰富度,分析寻常痤疮患者与健康人面部皮肤表面微生物群落的差异,确定差异物种,分析其对寻常痤疮形成及损害程度的影响,并进一步评价差异物种之间的相关性。痤疮患者应用复方黄柏液进行皮损部位湿敷治疗,通过分析患者治疗前后面部皮肤表面微生物群落在多样性和丰富度方面的变化,及对比患者经过治疗后面部皮肤微生物群落状态是否向健康人靠近。并且分析环境因子对痤疮患者的影响,筛选出与环境因子密切相关的物种,两两对比分析环境因子间的关系,研究与痤疮严重程度相关的环境因子及微生物物种。同时评价痤疮患者心理障碍情况,并通过环境因子分析找到与其相互影响的微生物物种,以及分析患者的心理状况对痤疮严重程度、患者依从性、患者满意度方面的影响。  研究方法:  收集符合轻中度寻常痤疮诊断标准的患者19例,取面部皮肤拭子,并予以复方黄柏液湿敷治疗14天,回收治疗后拭子样品17例;招募健康志愿者10例。将46例皮肤拭子样品提取总DNA,经两步PCR扩增,对PCR产物纯化和建库,根据所扩增的16SV4区特点,通过Illumina HiSeq PE250测序平台,采用双末端测序方法,进而构建小片段文库进行双末端测序。经过对Reads的拼接过滤,以97%的相似性对OTUs进行聚类,通过SILVA-128文库对OTUs进行物种注释,随即进行物种的丰度分析,揭示样品微生物群落物种构成;通过Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage指数进行Alpha多样性分析,研究样品组内的物种多样性;通过PCA、PCoA、UPGMA样品聚类树进行Beta多样性分析,研究分组之间的差异性;以Anosim、MRPP、Adonis、Amova分析进行组间群落结构差异显著性检验;使用LEfSe分析和MetaStat分析寻找具有显著差异的微生物物种;并以Network 分析法观察差异物种间的关系。使用Spearman法和CCA法进行环境因子分析,寻找与环境因子相关的物种;并通过统计分析环境因子之间的相关性。  研究结果:  46例皮肤拭子样品,测序共获得序列3,680,481条,聚类得到OTUs7125个,经注释得到3个界、53个门、124个纲、208个目、412个科、1049个属、743个种。测序覆盖率均达到99%以上,测序结果代表了样品的真实情况;稀释曲线和物种累积箱型图说明样品量已足够。本研究显示患者组与健康组皮肤表面微生物群落中丙酸杆菌属、葡萄球菌属、弧菌属、链球菌属、水栖菌属等均为优势菌种;痤疮患者丙酸杆菌属和金黄色葡萄球菌显著高于健康人;健康人面部皮肤的微生物多样性、丰富度方面均显著高于痤疮患者,且分布更加均匀;健康人样品之间个体差异性更大。痤疮患者经治疗后物种多样性和丰富度均有显著提高,微生物群落构成比例发生变化,样品间的个体性差异增大,呈现向健康人靠近的趋势。5个预实验组的结果显示测序的不同批次造成的差异大于待对比的组间差异。患者的焦虑程度和抑郁程度严重影响了其依从性和满意度。  研究结论:  痤疮患者丙酸杆菌属与金黄色葡萄球菌丰度高于健康人,二者是人类面部皮肤表面的高丰度常驻菌;经复方黄柏液湿敷治疗后痤疮患者的微生物群落显示逐渐向健康人靠近的趋势;非同批次进行的16SrRNA测序结果的差异可能大于分组间的差异;痤疮患者的心理状况影响其满意度和依从性,需要特殊注意;奥斯陆莫拉氏菌和弧菌属gigantis菌种为中国地区人类皮肤表面优势常驻菌,且健康人显著高于痤疮患者;中国地区人类皮肤表面微生物群可能与其他种族不同;健康人面部菌群的生物多样性和丰度均高于痤疮患者,皮肤微生态的平衡可作为皮肤正常免疫功能的一部分。
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