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第一部分 GTF2E2在食管鳞癌及术后复发组织中的表达和临床意义,及其表达对食管鳞癌细胞增殖与转移的影响目的:转录和转录后的遗传和表观遗传分子的变化与食管鳞癌的发生进展及患者的预后密切相关。本部分研究旨在探索转录因子GTF2E2在食管鳞癌及术后复发组织中的表达情况,及其与临床病理参数和预后之间的关系,并阐明干扰GTF2E2基因表达对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移侵袭和远处转移的影响。方法:通过生物信息学方法探索GTF2E2在食管鳞癌及癌旁组织中的表达情况及其与预后的关系;采用IHC实验检测组织芯片中GTF2E2在食管鳞癌及癌旁组织中的表达,并利用组织芯片临床病理数据分析GTF2E2表达与食管鳞癌临床病理参数和预后的关系;IHC实验检测食管鳞癌术后早、晚复发患者的GTF2E2表达,并分析GTF2E2表达与食管鳞癌术后复发患者临床病理特征的关系;采用RT-PCR和Western blot实验,检测 GTF2E2在人食管鳞癌细胞系KYSE-410,KYSE-150,KYSE-30,Eca-109,KYSE-450,TE-1细胞以及正常食管上皮细胞系HEEC细胞中mRNA和蛋白表达水平;转染慢病毒载体敲减及过表达食管鳞癌细胞中GTF2E2水平,RT-PCR和Western blot检测转染效率;CCK8、克隆形成、EdU和流式细胞学实验检测GTF2E2对食管鳞癌细胞体外增殖、凋亡的影响;采用Transwell和划痕实验验证GTF2E2对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响;免疫荧光和Western Blot实验检测GTF2E2表达水平与上皮间质转化标志物之间的关系;应用裸鼠皮下移植瘤模型验证GTF2E2对食管鳞癌细胞增殖的影响;应用裸鼠尾静脉转移模型验证GTF2E2对食管鳞癌细胞远处转移和预后的影响。结果:TCGA数据库及组织芯片免疫组化分析结果表明,食管鳞癌组织中GTF2E2表达显著高于癌旁组织。组织芯片临床病理数据分析发现,GTF2E2表达水平与食管鳞癌患者的N分期和临床分期密切相关,单因素Cox分析显示,N分期、临床分期和GTF2E2表达水平与食管鳞癌患者生存相关,多因素Cox分析结果表明,GTF2E2表达水平是食管鳞癌患者生存情况的独立预测因素,并且高表达GTF2E2患者总体生存期显著降低。食管鳞癌患者术后早、晚复发组织免疫组化结果表明,术后早复发组织中GTF2E2表达显著高于晚复发。术后复发组织临床病理数据分析发现,术后复发时间与食管鳞癌患者的性别和GTF2E2评分相关。RT-PCR和Western blot结果显示GTF2E2敲减及过表达细胞系构建成功。体外实验表明,与对照组相比,GTF2E2敲减后食管鳞癌细胞增殖能力显著降低、凋亡显著增加,同时迁移、侵袭能力明显降低,上皮标志分子表达增加、间质标志分子表达减少,而过表达GTF2E2后显示相反的结果。体内实验证实,与对照组相比,GTF2E2敲减可显著减缓食管鳞癌细胞的肿瘤形成,抑制远处肺部、肝脏转移,小鼠预后良好,而GTF2E2过表达后提示相反的结果。结论:GTF2E2在食管鳞癌及术后早复发组织中高表达,且高表达GTF2E2的食管鳞癌患者预后不良。此外,体外和体内实验结果共同提示,GTF2E2可促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭和转移。这些结果表明GTF2E2可作为食管鳞癌患者术后早复发的生物学标志物,以便患者及时选择后续的监测和治疗策略。第二部分 miR-139-5p调控GTF2E2对食管鳞癌细胞进展的影响和机制研究目的:miRNA在多种病理过程中发挥重要作用,越来越多的研究证实miRNA与食管鳞癌的发生发展有关。本部分研究旨在寻找并验证GTF2E2上游调控靶点,探究上游靶点分子在食管鳞癌组织中的表达情况及其与GTF2E2之间的关系,并阐明干扰上游靶点分子及GTF2E2基因表达对食管鳞癌细胞进展和转移的影响。方法:通过 TargetScan,miRWALK 和 StarBase 预测调控 GTF2E2 的 miRNA,采用RT-PCR实验进行验证,得到miR-139-5p并预测其在GTF2E2 3’UTR上的结合位点及突变位点序列。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验检测miR-139-5p对GTF2E23’UTR的荧光素酶活性的影响。通过TCGA数据库验证miR-139-5p在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况,并分析miR-139-5p与GTF2E2表达的相关性。通过向食管鳞癌细胞转染mimics或者Ihhibitor,构建miR-139-5p过表达和敲减细胞系,通过RT-PCR及Western blot实验检测miR-139-5p对GTF2E2 mRNA及蛋白表达水平的影响。随后采用 Western blot 检测 Eca-109 和 KYSE-150 细胞转染 miR-139-5p mimics及过表达GTF2E2后,或者TE-1细胞中转染miR-139-5p inhibitor及敲减GTF2E2后,GTF2E的蛋白水平。通过CCK8、克隆形成和EdU实验检测共转染miR-139-5p和GTF2E2对食管鳞癌细胞增殖的影响;采用Transwell实验验证共转染两个分子对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:本研究使用三种生物信息学工具取交集获得预测的8个miRNAs。在Eca-109和KYSE-150细胞中,分别转染8个miRNAs的mimics以过表达miRNAs,RT-PCR实验结果显示,在Eca-109和KYSE-150细胞中,miR-139-5p过表达后与GTF2E2 mRNA水平呈负相关关系。通过TCGA数据库分析发现,在食管鳞癌组织中,miR-139-5p低表达并且与GTF2E2成负相关关系。采用TargetScan预测miR-139-5p在GTF2E2 mRNA 3’UTR上的结合位点及突变位点序列,双荧光素酶报告基因实验显示过表达miR-139-5p能够显著减弱GTF2E2非突变端3’UTR的荧光素酶活性,敲减miR-139-5p能够显著增强GTF2E2非突变端3’UTR的荧光素酶活性,这些现象在结合位点突变后消失。RIP实验结果表明miR-139-5p可以通过Ago2蛋白靶定GTF2E2的3’UTR区域,从而在转录后水平影响GTF2E2基因的表达。RT-PCR结果显示,与对照组相比,转染miR-139-5p mimics组和miR-139-5p inhibitor组分别能够有效地增加和降低食管鳞癌细胞中miR-139-5p的表达。RT-PCR及Western blot实验结果显示,miR-139-5p能够负向调控食管鳞癌细胞中GTF2E2的mRNA及蛋白表达水平。Western blot 实验检测 miR-139-5p mimics 转染过表达 GTF2E2 的 Eca-109 和KYSE-150细胞后,结果提示过表达GTF2E2可逆转miR-139-5p mimics对GTF2E2蛋白水平的抑制作用。向敲减GTF2E2的TE-1细胞中转染miR-139-5p inhibitor进行反向验证,显示相反的结果。CCK8、克隆形成和EdU实验结果表明miR-139-5p通过抑制GTF2E2的表达从而抑制食管鳞癌细胞的体外增殖。Transwell实验结果表明miR-139-5p通过抑制GTF2E2的表达而抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力。结论:在食管鳞癌组织中,miR-139-5p低表达且与GTF2E2呈负相关关系。miR-139-5p通过Ago2蛋白与GTF2E2 mRNA 3’UTR上的特定位点结合,负向调控GTF2E2的表达,从而抑制食管鳞癌细胞的恶性生物学行为。第三部分 GTF2E2下游靶基因FUS的筛选验证及其对食管鳞癌细胞发展的影响和机制研究目的:探究转录调控的内在机制将为食管鳞癌的发展提供新的见解,可以为治疗和预后预测提供理论依据。本部分研究旨在筛选并验证GTF2E2转录调控的下游靶基因,阐明其在食管鳞癌组织中的表达情况及其与GTF2E2之间的关系,并探索干扰GTF2E2和下游靶基因表达对食管鳞癌细胞增殖、转移以及对信号通路活性的影响,以明确GTF2E2促进食管鳞癌恶性生物学行为的分子机制。方法:利用ChIP测序和转录组测序联合分析,寻找GTF2E2转录调控的靶基因。根据ChIP-seq结果中GTF2E2与靶基因启动子区的结合区域设计引物,通过ChIP-PCR实验验证。将ChIP-seq中GTF2E2和FUS的结合区域与具有显著差异的GTF2E2结合Motif序列进行比对,获取两者结合位点及突变位点序列。通过双荧光素酶报告基因实验检测GTF2E2对FUS启动子区的影响。通过TCGA数据库探索FUS在食管鳞癌组织中的表达情况,及其与GTF2E2表达的相关性。通过RT-PCR及Western blot实验检测干扰GTF2E2表达对FUS表达水平的影响,以及验证转染FUS敲减慢病毒载体及过表达质粒的转染效率。随后采用Western blot检测Eca-109和KYSE-150细胞中共转染GTF2E2和FUS后,FUS的蛋白水平和上皮间质转化分子的变化。通过CCK8、EdU和Transwell实验检测共转染GTF2E2和FUS对食管鳞癌细胞增殖、转移的影响。IHC实验检测第一部分构建的裸鼠皮下瘤、肺部和肝脏转移灶中FUS的表达情况。对RNA-seq和ChIP-seq的差异基因进行GO和KEGG富集分析,预测GTF2E2调控的信号通路,采用Western blot实验进行验证。结果:在ChIP测序中的结合基因与转录组测序中的下调基因集中,筛选到GTF2E2的靶基因FUS分子。ChIP-PCR实验提示GTF2E2蛋白可以特异性地与FUS启动子区富集。双荧光素酶报告基因实验显示,干扰GTF2E2表达能够显著影响FUS启动子区的荧光素酶活性,这一现象在结合位点突变后消失。通过TCGA数据库分析发现,食管鳞癌组织中FUS高表达并且与GTF2E2表达成正相关。RT-PCR及Western blot实验结果显示,GTF2E2能够正向调控食管鳞癌细胞中FUS的mRNA及蛋白表达水平,此外,FUS敲减和过表达细胞系构建成功。Western blot结果提示,敲减FUS可逆转过表达GTF2E2对FUS蛋白水平的增强作用,过表达FUS逆转了敲减GTF2E2对FUS的抑制作用。CCK8和EdU实验结果表明GTF2E2通过转录调控FUS促进细胞的增殖。体外实验结果表明GTF2E2通过增强FUS的表达而促进细胞的转移,使得上皮标志分子表达减少、间质标志分子表达增加。在敲低GTF2E2的皮下瘤、肺部和肝脏转移灶中,FUS免疫组化评分降低;在过表达GTF2E2的上述组织中,FUS评分增加。转录组测序和ChIP测序的GO和KEGG富集分析结合Western blot实验证实,干扰GTF2E2表达会影响AKT/ERK/mTOR通路的活性,这一影响是通过转录调控FUS产生的。结论:在食管鳞癌组织中,FUS高表达且与GTF2E2呈正相关关系。GTF2E2通过与FUS启动子区上的特定位点结合,正向调控FUS的表达,从而促进食管鳞癌细胞的进展和转移,并增强AKT/ERK/mTOR通路的活性。